固相萃取-高效液相色谱测定淀粉及淀粉制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐的含量
顺丁烯二酸也叫马来酸，顺丁烯二酸酐通过水解可以直接转化为顺丁烯二酸。作为一种人工合成的有机酸，顺丁烯二酸是重要的有机化工原料，顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐的用途非常广泛，主要用于制造混凝土高效减水剂、不饱和聚酯树脂、醇酸树脂漆、农药、润滑油添加剂等, 经深加工可生产1、4-丁二醇、酒石酸、富马、酸苹果酸[1]等化工产品。作为淀粉处理剂[2]，主要的作用是改善食品的弹性和黏性，以及改善食品外观光泽度,同时这种物质还可以增加淀粉的保质期[3]。但是顺丁烯二酸这种物质并不在食品添加剂卫生标准（GB2760-2011）允许添加的食品添加剂目录中[4]，也就是说马来酸这种物质并不是合法食品添加剂，如果用其来生产淀粉，这种行为也是违法。有研究发现顺丁烯二酸能损害眼部及肾脏[8]。市场上，有部分企业为了提高淀粉的弹性、粘度和稳定性，在食用淀粉中加入大量顺丁烯二酸淀粉酯，但由于技术等条件的限制，作为原料的顺丁烯二酸酐存在着大量的残留，从而使食用淀粉存在着巨大的食品安全隐患，因此，建立一种检测食用淀粉中的顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐的方法是非常必要的。
顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐的检测方法化学滴定法[1]，气相色谱法[9]，离子色谱法[10]，毛细管电泳法[11]和高效液相色谱法[12-15]等。由于技术条件的限制化学滴定法无法对样品中较低含量的顺丁烯二酸准确定量；毛细管电泳法由于技术条件的限制仍无法大规模应用；而气相色谱法和离子色谱法在应用方法条件上对检测的样品的限制使其很难应用在淀粉和淀粉制品上。目前，检测顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐比较准确有效的方法是高效液相色谱法，样品中残留的顺丁烯二酸酐通过水解也转化为顺丁烯二酸进行检测。然而由于淀粉及淀粉产品种类较多，成分复杂，而顺丁烯二酸的检测波长较低，在检测过程中存在很多的干扰，对结果的判断和准确定量有较大的影响，本实验利用LC-SAX 强阴离子交换固相萃取柱对样品进行净化，以去除复杂样品中的基质干扰，提高样品纯度和检测灵敏度[7]。方法操作简单，可靠，适用于对淀粉及淀粉制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐进行准确的定性及定量。
1材料与方法
1.1材料与试剂
顺丁烯二酸标准品(99% ，Sigma 公司) 。实验样品: 小麦粉，马铃薯淀粉，玉米淀粉，地瓜粉，变性淀粉，珍珠粉圆，复合淀粉均购于市场。甲醇( 色谱级) ，三氟乙酸( 色谱纯) ，无水乙醇( 分析纯) ，氨水（分析纯），硫酸（分析纯），氢氧化钠（分析纯）；强阴离子交换固相萃取柱 CNWBOND SAX 固相萃取小柱 500mg，6ml（购于上海安谱公司）。
1.2仪器与设备
Agilent1200 高效液相色谱仪-配二极管阵列DAD检测器( 美国Agilent 公司) ，; KQ5200超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；3k-3000 型高速离心机(最高转速15000r/min) 德国 Sigma 公司；Mili-Q 纯水系统美国Milipore 公司。
1.3方法
1.3.1标准溶液的制备
标准储备溶液(1.0mg/mL)的配制：称取顺丁烯二酸0.1000g于100mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度线，充分摇匀备用。此溶液于4 ℃冰箱中可储存3 个月。将标准储备溶液用水配制成 0.5、5.0、50.0、100.0、200.0μg/mL 混合系列标准溶液，使用前配制。
1.3.2试样处理
准确称取2.5g样品于50mL 塑料离心管中，加乙醇水（1：1）定容至刻度，充分摇匀，超声波提取10min，以3000r/min离心3min；取5.0mL 上清液加入一滴酚酞指示剂，取液用体积分数5% 氨水调至溶液变为浅红色，将液转移至已经过活化平衡的SAX 固相萃取柱中以自然流速过柱，待样品全部吸附后用3 mL水淋洗，流速约3 mL/min，抽至近干后，用2ml 0.1%硫酸以不超过1 mL/min 流速洗脱。洗脱液过滤后，供HPLC 分析。
1.3.3液相色谱操作条件
色谱柱：CNW®Athena C18-WP色谱柱(4.6mm × 250mm，5μm)；
流动相：0.1mol/LCF3COOH；流速1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样体积：20μL；
柱温：25℃。
1.3.4测定步骤
将标准工作溶液按照质量浓度由低到高的顺序进样测定，在215nm 波长处，以色谱图中的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线。试样溶液进样后，以色谱图中的保留时间及相应的光谱图定性，峰面积定量。
2结果与分析
2.1色谱柱的选择
由于检测目标物是极性小分子弱酸，易溶于水，在水系流动相中以离子形式存在，不能在非极性的键合相色谱柱固定相上保留，而在低PH值情况下，由于解离受到抑制，这时顺丁烯二酸在非极性C18 柱的固定相上保留而得到分离。方法使用低PH值的全水相流动相分析，对硅胶柱的键合相非常不利，导致色谱柱固定相填料塌陷，寿命大大降低，色谱峰的重现性也会受到严重影响，因此不能使用一般的C18 色谱柱进行分析。本文使用CNW®Athena C18-WP色谱柱(4.6mm × 250mm，5μm)进行标准品和样品的测定，由于CNW®Athena C18极性端基封尾C18色谱柱，不仅对非极性及强极性烷基化合物有超强保留，而且在100%水相流动相条件下对高极性化合物有强保留，试验结果也显示无论在峰形，响应度，还是稳定性，CNW®Athena C18-WP色谱柱都有较好的表现。
2.2固相萃取柱的选择
本文比较了C18、SCX和SAX 3种SPE 柱对淀粉制品中顺丁烯二酸萃取效果以及去除干扰物的效果。分别将调节pH 后的样品溶液直接过SPE 柱，收集了以C18 柱的净化液，以及SAX 和SCX柱的洗脱液进行分析，结果显示，尽管C18 对色素有较好的吸附作用，但对部分样品蛋白质的吸附作用较差，干扰了顺丁烯二酸的分析。SAX柱是以季胺基为填料，通过阴离子交换方式吸附有机酸，而蛋白质和部分色素则不被吸附，从而达到去除干扰物的目的。而SCX柱是以苯磺酸基为填料，通过阳离子交换方式吸附有机酸。从分析结果看，顺丁烯二酸在SCX 柱保留不如SAX柱，导致顺丁烯二酸的回收率偏低。这是因为顺丁烯二酸属于弱酸，其pKa>2，在弱阴离子交换柱中保留较好，需要使用强阴离子交换柱才能有较好的保留，因此选择SAX 柱进行净化。净化前后的色谱图见图1.
图1.SCX柱净化前后对比色谱图
Fig. 1 The chromatograms of maleic acid before andafter elution
2.3样品溶液PH值的确定
SAX 柱是以强阴离子交换形式，为了保证顺丁烯二酸被SPE柱有效吸附，需要通过调节样品pH值使之以阴离子形式被吸附。由于顺丁烯二酸是弱酸，其盐呈弱碱性，因此可用5%氨水溶液将样品溶液调至弱碱性，以确保待测物以离子形式存在于样品溶液中。
2.4淋洗液和洗脱剂的选择
当弱碱性的样品溶液进入SAX小柱，目标物被吸附在填料中，而色素及糖类不被吸附而流出SAX小柱，为了让目标物更好的与其它物质分离，需要用淋洗液淋洗SAX小柱，本文对比了超纯水、乙醇及50%的乙醇水三种溶液，发现超纯水同样能很好的净化SAX小柱，达到目标物与其它物质分离的目的，而且操作方便、快捷，故选用超纯水作为样品淋洗液。
为了使目标物从SAX柱上被洗脱出来，洗脱剂应选择强酸溶液，有机酸在酸性条件下以分子形式存在，致使SAX柱对其保留性大大降低，从而达到洗脱的目的。而洗脱剂的用量同样需要严格控制，洗脱剂用量不足时目标分析物不能完全从SPE 柱上洗脱，洗脱剂用量过多时会导致稀释倍数过大，本文分别比较了1 mL、2 mL、3mL 3 种不同上样量的0.1%硫酸和0.1盐酸对顺丁烯二酸洗脱效果的影响，结果表明两种相同浓度的酸溶液对顺丁烯二酸的洗脱效果相近，而洗脱剂超过2 mL时回收率能最大，因此选择洗脱剂用量为2 mL0.1%硫酸溶液。
2.5线性关系和检出限
配制质量浓度为0.1、0.25、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、160.0 、200.0、400.0mg /L 的顺丁烯二酸标准溶液，经HPLC 分析后，以顺丁烯二酸的响应峰面积(Y)对其质量浓度(X，mg/L)作标准曲线，其线性范围为0.5～ 200mg /L，线性方程为Y =96. 42X － 58. 26，相关系数r2 = 0. 9998，以3倍信噪比( S/N = 3)计算得方法的检出限（LOD）为1.5mg /kg。
2.6回收率和精密度
分别取玉米淀粉、变性淀粉和珍珠粉圆三种具有代表性的样品，进行了3个水平添加回收率实验，每个加标水平测定6次，方法回收率和相对标准偏差（RSD）见表3。回收率在88.9-94.7%之间，相对标准偏差在0.7-1.9%之间，说明方法的准确度和精密度达到分析要求。
表2 样品添加回收和精密度试验
Table2 The recoeries and RSD value ofCholesterol with different concentrations
3结论
本实验通过优化SPE 条件，并结合高效液相色谱仪进行检测，前处理方法采用SAX 强阴离子交换固相萃取柱对淀粉及淀粉制品进行净化的方法能更好的消除杂质干扰，定量更准确。同时，本实验采用的CNW®Athena C18-WP色谱柱对顺丁烯二酸具有较好的保留，在低PH值的纯水相环境下可对顺丁烯二酸准确定性和定量。本实验所建立的固相萃取-高效液相色谱方法具有分离效果好、定量准确、干扰小、灵敏度高等优点，适用于复杂样品的测定，便于在食品检测机构中推广应用，对食用淀粉行业的监管能起到积极的作用。
应助达人
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