CNW Athena C18测定小鼠排泄物中地喹氯铵的含量
地喹氯铵（dequalinium chloride）是一种广谱的抗菌药物，主要用于急性咽喉炎和口腔炎症治疗。它的抗菌机理主要是作为一种阳离子表面活性剂，能吸附于细菌的细胞壁上，改变其通透性，使菌体内的酶、辅酶和代谢中间产物外漏，妨碍了细菌的呼吸和糖酵解过程，并使菌体蛋白变性，从而发挥杀菌作用[1,2]。最近我们的研究发现地喹氯铵对几丁质酶家族中的二-N-乙酰壳二糖酶（Di-N-acetylchitobiase，简称CTBS）有很强的抑制作用，在体外可以显著抑制小鼠的精卵结合作用[3]。由于CTBS只有在啮齿类动物精子上有特异性表达，而在其他动物的精子上没有[4,5,6]。因此它具有潜在的鼠类特异性生育控制药物的开发价值。为动物活体试验中准确定量用药和确定小鼠对该药物的代谢基本情况，需要建立相应的药物分析方法。我国药品标准和英国药典对地喹氯铵原料药的含量测定都采用非水滴定法，制剂含量测定虽然采用HPLC测定法，但由于鼠类排泄物中组成和制剂组成不同，采用现行标准条件[7]对排泄物中地喹氯铵进行含量测定，地喹氯铵主峰与杂质峰无法达到有效的分离。本文参考日本制剂中的检验方法，优化其色谱条件，使地喹氯铵主峰和相邻杂质峰达到有效分离。用优化后确立的色谱条件对地喹氯铵进行质量研究，结果显示本法适用于排泄物中地喹氯铵的测定。
1 材料和方法
1.1 仪器
BSA124S-CW精密天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；aglient1100型高效液相色谱仪（安捷伦公司）；2-16PK高速冷冻离心机（SIGMA中国有限公司）；色谱柱：CNW Athena C18柱（4.6mm×250mm，5μ）（上海安谱科学仪器有限公司）；依利特Hypersil C18柱（10μ，4.6mm×250mm）（大连依利特分析仪器有限公司）。
1.2试药和试剂
氯化钠、十二烷基硫酸钠、三乙胺、磷酸、丙酮（上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇、
乙腈（上海泰坦化学有限公司）；地喹氯铵（Sigma公司，纯度=99%）
1.3 实验方法
1.3.1标准溶液制备
精密称取105℃干燥至恒重的DQC标准品1mg，加入现配的甲醇-水-磷酸（体积比15:5:1）混合液（下简称稀释剂）1ml，超声溶解10min。
1.3.2样品溶液制备
12只ICR健康雄鼠，分成4组，3只一组置于笼中，采用水中加药法分别连续给药二周，地喹氯铵浓度设置为0、10mg/L、50mg/L、125mg/L。收集给药两周后的排泄物，在通风环境下干燥一星期后，室温保存。取排泄物2.5g，加水25ml。超声溶解15min，抽滤，再用10ml水洗涤滤饼2次。合并滤液，加入氯化钠至饱和，用25ml丙酮萃取三次。离心（转速8000rpm，温度4℃，时间20min）。取上层清液，减压蒸馏得固体，用1ml甲醇溶解，过0.45μm膜后进样分析。
1.3.3色谱条件
色谱柱：CNW Athena 120A C18柱（4.6mm×250mm，5μ）；流动相：含0.05M 十二烷基硫酸钠和1%三乙胺的水溶液（磷酸调至pH=3.5）：乙腈=32：68；检测波长：240 nm；流速：1.0ml/min；进样量：20µl。
2。结果与讨论
2.1 不同色谱柱的比较
取地喹氯铵标准溶液定量添加到按1.3.2方法得到对照组样品溶液中，分别采用Hypersil C18柱（10μ，4.6mm×250mm）和CNW Athena 120A C18柱（4.6mm×250mm，5μ），在同一台色谱仪均以75%甲醇水溶液为流动相进行分析，根据色谱图比较选择合适的色谱柱。
结果表明，采用Hypersil C18柱的分离效果差、与杂质分离不彻底，峰型拖尾严重（图1a）；而采用CNW Athena 120A C18柱（4.6mm×250mm，5μ）分析，样品峰型基本对称、与杂质分离度高，基线基本无干扰（图1b）。故以后的实验全部选择CNW Athena C18柱进行。
图1a，Hypersil C18柱 图1b，CNW Athena C18柱
2.2线性关系
将前述准备的标准溶液储备液分别稀释制成浓度为5、10、20、30、40、50mg/L的溶液，分别进样测定，记录峰面积（表1）。
表1，DQC标准溶液浓度与峰面积对应表
以峰面积（P）为纵坐标、浓度（N）为横坐标作图（图4）。
图4，浓度与峰面积工作曲线
以浓度（N）对其相应的峰面积（P）作最小二乘法线性回归，得到工作曲线P=24639.56×N－45269.10，r=0.9996。该结果表明地喹氯铵在5-50mg/L的浓度范围内，其峰面积与浓度呈良好线性系。
2.3精密度
取40mg/L的标准溶液，重复进样5次，依次测定，记录峰面积。峰面积平均值966218.8uV*s，RSD=1.96%，结果（表2）表明精密度良好。
表2，精密度试验结果表
2.4回收率
取空白对照排泄物2.5g三份，分别加入50mg/l的地喹氯铵标准溶液1ml，混匀。然后按1.3.2方法处理得到加样样品，按1.3.3方法测定，根据标准曲线计算测定样品中浓度，再根据稀释倍数计算样品量和实际加入量之比，得回收率。结果（表3）表明，采用该方法测定加标样品的平均回收率为101.17%，表明该方法可用于测定排泄物中药物含量。
表3，回收率测定表
2.5实际样品测定
根据1.3.2方法得到实际不同给药量后的小鼠排泄物样品溶液，分别进样，记录峰面积，计算各代谢物样品中药物的含量。结果（表4）表明，排泄物中的药物含量随给药浓度的增加而增加。排泄物中的药物来源主要有两个，一是给药过程含药溶液少量泄漏，二是未经小鼠吸收而直接排出。因此，小鼠实际药物摄入量等于给药量减去排泄物中的药物量。
表4，排泄物中地喹氯铵的谱图数据
2.6 结论
利用地喹氯铵的水溶特性以及丙酮与饱和盐溶液可分层的原理，对样品预处理。采用HPLC方法进行定量分析，优化色谱条件为：CNW Athena C18柱，流动相为含0.05M 十二烷基硫酸钠和1%三乙胺的水溶液（磷酸调至pH=3.5）：乙腈=32：68；检测波长：240 nm；流速：1.0 ml/min。采用该优化的色谱条件，样品峰分离度高，线性关系良好、回收率和精密度均达到分析的要求。
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