女贞叶为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的叶,具有清热明目,解毒散瘀,消肿止咳之功效。主要用于头目混痛,风热赤眼,疮肿溃烂,烫伤和口腔炎。三萜类化合物是女贞叶中的主要活性成分,目前对女贞叶的含量测定的相关报道较少,大多为测定其中一个或两个三萜类成分,不能全面、有效地评价女贞叶的整体质量。本实验建立了同时测定了19α-羟基熊果酸、2α-羟基熊果酸、3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸、齐墩果酸、熊果酸5种三萜类成分的高效液相色谱法,为女贞叶的质量控制提供科学依据。
1 仪器与材料
Agilent 1100液相色谱仪,BS210S型电子天平(德国Sartorius公司),电热恒温水浴锅(上海精宏);乙腈、甲醇为色谱纯(美国J.T.Baker)水为Milli-Q超纯水,其余试剂均为分析纯。
熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110742-200415);齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110709-200304);19α-羟基熊果酸对照品、2α-羟基熊果酸对照品及3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸对照品[6](均为自制对照品,纯度均>98%)。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 分别取5种对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含19α-羟基熊果酸28.50 μg、2α-羟基熊果酸49.44 μg、3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基-齐墩果酸8.11 μg、齐墩果酸149.8 μg、熊果酸345.5 μg的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备 取女贞叶粉末约4 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%乙醇50 mL,称定重量,加热回流2 h,放冷,再称定重量,用75%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,既得。
2.3 色谱条件
色谱柱:大连依利特Kromasil C18液相色谱柱(4.6 × 250 mm,5 μm);
流动相:甲醇-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(53:27:20);
检测波长:205 nm;
流速:1.0 mL/min;
柱温:15 ℃;
进样量:10 μL。
HPLC图谱见图1 。
图1 混合对照品(A)与女贞叶样品(B)液相色谱图
1. 19α-羟基熊果酸 2. 2α-羟基熊果酸 3. 3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸 4. 齐墩果酸 5. 熊果酸
3 讨论
19α-羟基熊果酸、2α-羟基熊果酸、3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸、齐墩果酸、熊果酸五中物质的母核结构相同,最大吸收波长均在203~206 nm,在205 nm处所得结果灵敏度较高,其他色谱峰干扰较少,故选择波长为205 nm。由于齐墩果酸和熊果酸为同分异构体,性质相似,给分离带来较大困难,曾以甲醇-水、乙腈-水等系统[6-10],并在流动相中加入磷酸、冰醋酸、乙酸铵等试剂,通过调整比例,最后选用甲醇-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(53:27:20)作为流动相。此外,柱温对熊果酸与齐墩果酸的分离影响很大,温度越低分离度越高。采用资生堂CAPCELL PAKC18(250×4.6 mm,5 μm)考察,柱温为35℃时,熊果酸与齐墩果酸的分离度为1.56,30 ℃时,熊果酸与齐墩果酸的分离度为1.60,而15 ℃时,熊果酸与齐墩果酸的分离度可以达到3.0,从而得到很好的分离效果,最终确定柱温为15 ℃。