聚乙二醇在新型药剂的应用和质量控制

liufeilzu

2014/12/17

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化学药检测

聚乙二醇在新型药剂的应用和质量控制

摘要：聚乙二醇是常用的药用辅料，有不同的分子量规格。聚乙二醇在新型药剂中有广泛应用，其修饰的药物和纳米粒制剂可以有效提高药物利用度，减少副作用，提高病灶组织药物浓度。本文简单介绍了聚乙二醇化的新型药剂实例，比较了主要药典对聚乙二醇的质量控制方案，结合新的分析方法，介绍了聚乙二醇及其衍生物质量控制的快速简便方案。

1聚乙二醇

图1 聚乙二醇结构和化学通式。

聚乙二醇（polyethylene,PEG）由环氧乙烷和水缩聚而成 (图1)，n代表基本单元氧乙烯基的平均数目。低分子量的聚乙二醇为粘稠的液体，当平均分子量超过1000，聚乙二醇为白色的蜡状固体。在中国药典收录作为辅料的常用聚乙二醇辅料有分子量400、600、1000、1500、4000、6000共6种规格。聚乙二醇是传统的药用辅料，一般作为赋形剂使用，或者作为药物的分散剂。随着药物输送系统的发展，目前聚乙二醇在制药技术的应用主要有两个方面：药物的聚乙二醇修饰和修饰纳米粒的骨架结构[1]。

2聚乙二醇在新型药剂中的应用

聚乙二醇两端的羟基可以方便的被修饰（图1B R₁和R₂）,如羟基甲基化形成聚乙二醇单甲醚，也可以用来直接和药物基团反应，形成药物和聚乙二醇复合物。大量实验和研究表明药物和聚乙二醇复合物是一种有效的药物输送手段，它可以有效延长药物的半衰期，增加药物溶解性，提高药物的安全性[2]。

传统的抗肿瘤小分子是聚乙二醇修饰的主要目标。聚乙二醇修饰的柔红霉素（daunorubicin）改善药物的溶解性和水溶液稳定性，增加了药物在血液中的循环时间。在临床Ⅲ期治疗Kaposi^，s肉瘤的研究中，对比阿霉素的治疗效果，聚乙二醇修饰的柔红霉素显著降低了毒性，减缓了中性中性粒细胞减少症[3]。与聚乙二醇修饰小分子药物相比，聚乙二醇修饰的蛋白质药物获得的进展更为引人关注。第一个上市的聚乙二醇修饰的蛋白质药物是腺苷脱氨酶，Enzon公司在1991年推出。聚乙二醇修饰蛋白质药物最成功的例子是安进（Amgen）推出的Neulasta（培非格司亭）（聚乙二醇修饰的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）），Neulasta的销售额在推出的第一年就超过了原研药非格司亭。Neulasta（培非格司亭）主要治疗多种癌症化疗导致的嗜中性白血球减少症，降低化疗病人的感染风险。从2002年到2006年的临床试验证明，Neulasta具有长达48小时的血液半衰期，较高的用药安全性[4]。据GEN报道，Neulasta（培非格司亭）在2012年销售额达40.92亿美元，全球畅销药排名12。

聚乙二醇是柔性亲水链，通过与磷脂或高分子聚合物聚合（图2C），可以延长纳米粒的体内循环时间[5]。目前最成功的是阿霉素脂质体Doxil®。Doxil脂质体的组成中最特别的是引入了聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺（PEG-PE)，它可以增加有效成分多柔比星的半衰期，与常规多柔比星制剂相比，Doxil在将生物利用度提高了90倍。在纳米粒上的聚乙二醇端羟基引入具有特定的分子（图2C R₂），可以提高纳米粒的靶向性。Erric等采用引入肽段的方式设计了针对整合素的靶向纳米粒[6]，抑制了肿瘤的转移。

3聚乙二醇的质量控制

作为传统辅料，聚乙二醇在各个主要药典中均有收录(表1)。中国药典（2005、2010版）和美国药典(USP32和USP35)对聚乙二醇质量控制做了详细的要求。欧洲药典（EP7.0）把聚乙二醇作为通用试剂，对其质量控制仅从性状做了一些简单要求。

从整体上对比中国药典和美国药典对聚乙二醇的检测项目，中国药典的检测内容更为详细，在性状和常规检查性规定了更多检测内容，同时增加了美国药典没有的鉴别项。残留的杂质检查中，两部药典的检测内容几乎一致，中国药典多了甲醛检测项，但是美国药典的检测条件更加严格。如对环氧乙烷与二氧六环的检测中，美国药典要求一次使用3千克的样品减压蒸馏，并用氮气保护，中国药典对聚乙二醇的处理方法是仅用约50g的样品旋转蒸发。乙二醇和二甘醇的检测方法也有不同之处，中国药典统一采用气相色谱方法检测，美国药典要求分子量小于450的用气相色谱法检测，分子量大于450的采用衍生液相色谱方法检测。

表1 主要药典质控方案

聚乙二醇分子量的大小与新型药剂的质量直接相关。在采用聚乙二醇修饰的药物时，需要考虑聚乙二醇分子量对药物半衰期的影响；聚乙二醇分子量会直接影响纳米粒的大小，从而影响纳米粒药剂的治疗效果。一般来说，修饰药物的聚乙二醇分子量达数万，而修饰纳米粒的聚乙二醇分子量通常在1500—5000之间。中国药典和美国药典均采用滴定聚乙二醇的端羟基数目的方法测定数均分子量，该方法采用吡啶为溶剂，过量邻苯二甲酸酐与聚乙二醇端羟基反应，再用氢氧化钠滴定邻苯二甲酸酐，计算邻苯二甲酸酐消耗量，结合聚乙二醇称量值计算分子量。该方法不需要特殊的设备，但是操作繁琐，污染大。除了聚乙二醇分子量信息之外，获得聚乙二醇分子量分布信息可以有效控制制剂的质量均一性，聚乙二醇分子量分布与纳米粒粒径的分布直接相关。传统的获取分子量分布的分析方法是采用凝胶过滤色谱（GPC）或尺寸排阻色谱（SEC）方法（图3），新型软电离质谱可以分析分子量大于1000的物质，图4是利用基质辅助激光解吸时间飞行质谱（MALDITOF）直接获得聚乙二醇分子量质谱图（图4），该方法数据直观，操作过程简便，从制备样品到数据分析耗时不超过5分钟。采用GPC分析嵌段聚合物，不容易找到性质相似标准物，获取准确分子量需要采用多检测器串联技术，而且当分析物分子量低于5000时，系统误差会造成很大影响。TOF正好可以克服上述GPC缺点，时间飞行质谱可以不用标准物质直接读取分子量，TOF的质量数准确度明显比GPC多检测器串联的计算值准确。

图3相同数均分子量不同分散度的聚乙二醇GPC色谱图。对称性不好的色谱峰在聚合合成中工艺控制不当。Waters2414视差折光检测器，Empower2软件。色谱柱，AngilentPLgel低分子量截至色谱柱。

图4 聚乙二醇3350 MALDI TOF质谱图。基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸，反射模式。采用Bruker公司的聚合物软件对该质谱图进行计算，数均分子量Mn=3382.83，重均分子量Mw=3418.87。

聚乙二醇制剂工艺过程中，端羟基活化修饰一般是工艺的第一步，常用的有形成PEG—对硝基苯酚、PEG—碘乙酰胺等关键中间体。核磁共振方法（NMR）可以快速检测聚乙二醇的活化修饰程度。具体操作方法为：寻找活化修饰基团特殊的质子，如苯环上化学位移7ppm左右的质子，积分该质子，然后寻找聚乙二醇结构单元氧乙烯基[CH2CH2O]（化学位移在3.5-3.8ppm）并积分。比较修饰基团上质子数与氧乙烯基质子数的比值，判断聚乙二醇端羟基的修饰程度（修饰不完全、单修饰、双修饰等）。以聚乙二醇甲醚为例（图5）：已知分子量为2000，单甲醚的甲基与氧乙烯基质子数比值约为1:60，双甲醚的比值约为1:30。实际测定值为1:56，可以判定为聚乙二醇单甲醚。

图5 聚乙二醇单甲醚2000的一维核磁氢谱图。

4总结

聚乙二醇在新型制剂中的应用发展迅速，聚乙二醇修饰的药物和纳米粒子具有独特的疗效，市场前景广阔。目前我们在发展聚乙二醇修饰的新制剂过程中，以美国药典和中国药典的质控方案为参考。对影响制剂质量的重要指标，采用新的分析技术，可以得到更加详细的结构信息。

参考文献：

[1] Jokerst JV,Lobovkina T, Zare RN, Gambhir SS. Nanoparticle PEGylation for imaging andtherapy. Nanomedicine 2011;6:715-28.

[2] Hamidi M, Azadi A, Rafiei P. Pharmacokinetic consequencesof pegylation. Drug delivery 2006;13:399-409.

[3] Gill PS, Wernz J, Scadden DT, Cohen P, Mukwaya GM, vonRoenn JH, et al. Randomized phase III trial of liposomal daunorubicin versusdoxorubicin, bleomycin, and vincristine in AIDS-related Kaposi's sarcoma.Journal of clinical oncology : official journal of the American Society ofClinical Oncology 1996;14:2353-64.

[4] Ricotta R, Cerea G, Schiavetto I, Maugeri MR, PedrazzoliP, Siena S. Pegfilgrastim: current and future perspectives in the treatment ofchemotherapy-induced neutropenia. Future oncology 2006;2:667-76.

[5] Klibanov AL, Maruyama K, Torchilin VP, Huang L.Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time ofliposomes. FEBS letters 1990;268:235-7.

[6]Murphy EA, Majeti BK, Barnes LA, Makale M, Weis SM, Lutu-Fuga K, et al.Nanoparticle-mediated drug delivery to tumor vasculature suppresses metastasis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America2008;105:9343-8.