液相色谱串联质谱法测定动物组织中甲硝唑的残留量
摘要：采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪（LC-ESI-MS-MS），建立了猪肉中甲硝唑药物残留的检测方法，试验中猪肉中甲硝唑的残留用乙酸乙酯提取，以替硝唑作为内标，提取液经涡旋、离心、浓缩，经MCX固相萃取柱净化，甲醇-5%氨水洗脱，洗脱液氮吹浓缩定容至1ml，供液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。本方法采用了1ug/kg,2ug/kg, 3ug/kg,3个添加浓度，每个浓度6个平行样品，甲硝唑药物残留的回收率在100%~110%，相对偏差在1.5%~1.8%。
关键词：液相色谱串联质谱法；甲硝唑；猪肉；
1引言
甲硝唑，主要用于治疗或预防上述厌氧菌引起的系统或局部感染，近年来，广泛地应用于抗厌氧菌感染。本品的硝基，在无氧环境中还原成氨基而显示抗厌氧菌作用，对需氧菌或兼性需氧菌则无效。是畜牧生产中最常用的硝基咪唑类药物，具有抗厌氧菌和抗原虫作用，主要用于治疗厌氧菌感染。研究表明，甲硝唑对细菌有诱变作用，对实验动物具有致癌性，人用药后有恶心、呕吐、腹泻、皮疹等副作用，其在动物性食品中的残留对人存在潜在危害。
由于硝基咪唑类药物潜在的致诱变、致癌和神经毒性，因此，动物源性食品中硝基咪唑类药物残留量的检测技术，日益受到国内外学者的关注。但是，目前的测定方法主要以高效液相色谱法为主，此方法的检测灵敏度较低，检测限也达不到要求，此外还有液质联用法，但对于该方法的研究比较少。本研究旨在建立更加灵敏、准确而精密的方法,用于检测甲硝唑在动物组织中的残留。
2实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1试剂和材料
甲醇：德国默克，色谱纯
乙腈：德国默克，色谱纯
水：1.25L哇哈哈纯净水（杭州产）；
盐酸：分析纯
氨水：分析纯
正己烷：德国默克，色谱纯
甲酸：色谱纯
冰乙酸：分析纯
无水硫酸钠：分析纯
猪肉：取自养殖基地。
标准品：购置于DR公司,纯度>95%。
MCX小柱：agela，60mg/3mL。
标准贮备液：称取各标准品10.0mg，分别放于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，4℃保存。
1.1.2仪器
液相色谱—质谱仪（LC-MS-MS）AB5500,ESI源、
电子天平（美国奥豪斯）、
旋转蒸发仪（瑞士Buchi）、
冷冻离心机（美国贝克曼）
研磨仪（德国莱驰）、
超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、
棒状均质器（IKA T18）、
涡旋混合器（IKA），
固相萃取器（天津奔腾）。
1.2样品提取
称取（2+0.02g）试样于50ml离心管中，用15ml乙酸乙酯，涡旋混匀，离心，上清液转移至100ml鸡心瓶中，残渣用15ml乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，40℃水浴下旋转浓缩至干。
1.3 样品净化
加0.1mol/l的盐酸3ml，涡旋充分溶解残渣，转移至15ml离心管中，向鸡心瓶中加3ml正己烷摇1min，转移至同一离心管中，振摇，离心，弃去正己烷层，再加0.1mol/l盐酸3ml于鸡心瓶中，涡动1min，合并两次盐酸溶解液，加3ml正己烷重复去脂一次，除尽正己烷层备用；取MCX小柱，依次用2ml甲醇和2ml0.1mol/l盐酸活化，过样液，再用0.1mol/l盐酸溶液1ml、甲醇1ml、甲醇-2%氨水（10:90）1ml淋洗，流干，甲醇-5%氨水（60:40）3ml洗脱，收集洗脱液。40℃水浴下氮气吹干，加流动相1ml（乙腈：水5:95体积比）溶解，过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。
1.4 色谱-质谱条件
液相条件：C18色谱柱，流速0.3ml/min，流动相1‰甲酸水和乙腈梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，雾化气、辅助气、气帘气、碰撞气调节气体流量使质谱灵敏度达到最佳。
3 数据分析
3.1 色谱质谱条件的优化
流动相优化如下：
色谱柱：C18，100mm*2.1mm*5um或相当，柱温30℃
流动相：水：乙腈，流速0.3ml/min，
3.2质谱条件
A. 离子源:电喷雾离子源ESI
B.扫描模式：正离子扫描
C．检测方式：多反应检测（MRM）
D.点喷雾电压：5500V
C.气帘气：35，GS1:45,GS2:55,DP:60V,EP:10V,CXP15,离子源温度500℃
D.定量定性离子和碰撞能量条件如下：
3.2 线性方程
配置混合标准标准系列工作液，浓度为0，0.50，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ug/L。分别以选定的定量离子峰面积与内标物的峰面积的比值对浓度绘制标准曲线，甲硝唑药物在0.50~5ug/L的范围内呈良好线性，r均大于0.99。
3.3 回收率试验
取同一批阴性样品，加入适量的混合标准液，使加标量在1ug/kg、2ug/kg、3ug/kg三个浓度，每个浓度做6个平行，求其平均回收率，并计算批内相对标准偏差。
4结果讨论
4.1固相萃取柱的选择
实验中分别取加入5ug/kg的标准品到样品中，利用C18和MCX净化，结果发现MCX小柱的回收最高，因此选择MCX小柱为本试验的固相萃取小柱。
4.2提取溶剂的选择
实验中分别选用了甲醇、乙腈、乙酸乙酯为提取溶剂，对试样进行提取过MCX小柱净化，过滤上机检测，结果发现乙酸乙酯为提取剂的回收效果最好，响应最高。
4.1质谱条件的优化
取0.5mg/kg的标准品用蠕动泵的方式直接进入质谱，由于化合物本身的特性，该化合物在正离子源模式的响应及稳定性要高于负离子源模式，因此我们选用正离子源模式；调试离子源的喷雾电压，查看化合物Q1离子图的响应，发现化合物在喷雾电压5500V的条件下，Q1的响应最高，因此设定喷雾电压5500V，根据化合物的响应选取合适的气流量；;在Q3的模式下选取响应较高较稳定的3个子离子，在MRM模式下，选取各子离子响应最高最稳定的碰撞能量，因此根据选好的各参数设定了该方法的质谱条件。
4.2数据分析
实验过程中从不同的超市和市场抽取了多份猪肉样品进行检测，结果发现未有阳性的样品，说明该地区养殖户未曾使用该药物，该地区的产品是可以放心使用的。
4.3小结
该试验证明本方法简便、快速、准确,方法的定量下限为1ug/kg，高效液相色谱串联质谱法测定猪肉组织中甲硝唑残留达到目前国际上检测甲硝唑残留的先进水平,可用于猪肉中甲硝唑残留的确证检测。
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