1 前言
肉桂（Cinnamomumcassia presl）为樟科植物的干燥枝皮或干皮，肉桂中含有挥发油（称肉桂油或桂皮油），其中主要成分为桂皮醛（Cinnamaldehyde），另含少量桂皮酸、乙酸桂皮酯、肉桂醇及香豆素等，有抑菌防腐作用，可提取用于食品防腐保藏。花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）为芸香科植物，花椒的干燥成熟果皮、果实含挥发油，其中主要成分为牻牛儿醇（Geraniol）、萜品醇、香茅醇、柠檬烯、水芹烯和蒎烯等，具有抑菌防霉作用，可用作粮食防霉。花椒不仅可作为调味品，也可作药用，具有镇痛、镇静、活血散瘀及治疗呕吐、腹泻等功效，另外在抑菌杀虫、抗肿瘤等方面也具有较强的药理活性。由于挥发油的化学组成多为含醇、醛、酮、酚、酸、酯、萜烯类等的混合物，易溶于多种有机溶剂及脂肪油中，在一定浓度的乙醇中溶解度较高，考虑到作为食品防腐剂的安全性，本文选用食品级乙醇作为提取剂，对提取条件及提取物的抑菌作用进行了实验研究。
2材料和方法
2.1实验材料及仪器
2.1.1材料
肉桂，将其粉碎备用
花椒，将其粉碎备用
2.1.2化学试剂
NaCl ，北京北化精细化学品有限责任公司
NaNO3 ，北京益利精细化学品有限公司
K2HPO4 ，北京益利精细化学品有限公司
KCl ，北京益利精细化学品有限公司
MgSO4 ，北京益利精细化学品有限公司
FeSO4 ，北京益利精细化学品有限公司
醋酸钠，北京北化精细化学品有限责任公司
HCl ，北京北化精细化学品有限责任公司
NaOH ，北京北化精细化学品有限责任公司
食用乙醇95%，北京北化精细化学品有限责任公司
2.1.3生化试剂
牛肉膏，北京双旋微生物培养基制品厂
蛋白胨，北京双旋微生物培养基制品厂
琼脂，北京双旋微生物培养基制品厂
蔗糖，北京双旋微生物培养基制品厂
葡萄糖，北京双旋微生物培养基制品厂
2.1.4实验仪器
电热鼓风干燥箱DL-101-3 ，天津市中环实验电炉有限公司
电热恒温培养箱DHP-9272型，上海一恒科技有限公司
SHK-99-11 摇床 ，Beijing North TZ-BiotechDevelop. Co.
DSY-2-8 电热恒温水浴锅，北京国华医疗器械厂
LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂
HD-1360 洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司
SHB-111 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司
单相电容运转电动机 JX50.24 ，上海申顺生物科技有限公司
W201 恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司
FA1004A 电子天平，上海精天电子仪器有限公司
飞利浦二合一搅拌机 H2839 ，珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司
722分光光度计，上海棱光技术有限公司
2.1.5主要菌种
细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）
霉菌：米曲霉（Aspergillus oryzae）
由食品科学与工程系实验室提供。
将所有供测试的菌株移接入相对应的试管斜面培养基上，每种接多支重复。细菌置于37℃恒温培养箱内培养24 h；霉菌于28 —30℃培养48—72 h。每种菌取2支供测试用，其余置4℃冰箱冷藏备用。
2.1.6培养基
(1)细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的制备：牛肉膏：5g；蛋白胨：10g；NaCl：5g；pH：7.0—7.2；琼脂：15-20g（固体用）；蒸馏水：1000g；灭菌， 121℃，20min。
(2)霉菌培养基（查氏培养基）的制备：NaNO3：2g；K2HPO4：1g；KCl：0.5g；MgSO4：0.5g；FeSO4：0.01g；蔗糖：30g；琼脂：15-20g；水：1000ml；pH：自然；灭菌，121℃，20min[11]。
2.2实验方法
2.2.1实验准备部分
(1)肉桂、花椒提取物的制备
将肉桂和花椒分别用粉碎机粉碎后保存，取肉桂（花椒）粉末25g，放入三角瓶中，用95%乙醇，依照固液比1：8，提取温度为65度，每次提取时间为3小时，共进行3次提取，将三次的提取液合并，用双层滤纸过滤，得到提取液，倒入梨形瓶中，放入旋转薄膜蒸发器中进行旋转蒸发，蒸发至其25ml左右，倒入25ml容量瓶中用水定容备用。即得到1ml提取液中含有1g肉桂（花椒）材料的提取物。
(2)细菌的对数生长曲线的测定
在超净台内从斜面培养基上取一环菌，接种于已灭菌的盛有50ml液体培养基的三角瓶中，培养细菌的三角瓶置于37℃，培养霉菌和酵母菌的三角瓶置于28℃的恒温摇床中连续培养14小时左右，其间每小时取1ml菌液测其吸光度值。记下每次测量数值作为纵坐标，时间以h为单位做横坐标绘制图线，找出纵坐标明显上长的时间段即为对数生长期。分别测定大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌三种菌的对数生长曲线。
(3)菌悬液的制备
对于细菌，则用处于对数期的菌。对于霉菌，则用接种环挑取一环菌体细胞或孢子放入装有灭过菌的50 ml无菌水的试管里，充分振摇10 min，制成菌体悬液或孢子悬液备用。
2.2.2抑菌实验
(1)倒入适量（约4毫米厚）已灭菌的培养基（温度约45度）灭过菌的（121度，20分钟）培养皿中，静置凝成平板。
(2)将培养皿放入恒温箱中至其表面水蒸气蒸干，以免影响试验结果。
(3)将已经培养好的菌制成一定浓度的悬浮液，取0.1ml该菌悬液至培养皿中，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布于培养基表面。
(4)用无菌针孔在培养基表面打出三个孔，将配好浓度的抑菌液注入。
(5)按上述方法，每个浓度做3个重复，以灭菌水做空白对照。
(6)在适当温度下培养一定时间后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小。
2.2.3最低抑菌浓度（MIC）的测定
(1)配制抑菌剂：以水作为溶剂，将肉桂提取物（花椒提取物）配成浓度为1g/ml的溶液，定容于25ml容量瓶，待用。
(2)灭菌：取28支试管，各移取5.0ml培养基，121℃，20min灭菌备用。
(3)接种：无菌操作，将活化了18h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌依次接种在其液体培养基中，培养至每种菌的对数期时用微量吸管分别移取100ul菌液加入到各个灭菌培养基试管中，摇匀。将米曲霉接种在无菌水中，充分摇匀后得到孢子菌液，用微量吸管分别移取100ul菌液加入到霉菌灭菌培养基试管中，摇匀。
(4)配置培养基：
在上述注入菌液的各灭菌培养基中滴入不同体积的提取物溶液，如下表，配制成含不同浓度提取物的培养基，细菌在37℃，霉菌在28℃，培养12-16小时。并且每种培养基配置空白对照，以辨明其抑菌程度。
(5)经过培养，观察其培养基的混浊程度来判断其长菌程度，来确定其最小抑菌浓度。
(6)将上述抑菌范围再稀释合适梯度，同样操作，进一步得到更窄的抑菌范围。
3结果与讨论
3.1三种细菌的对数期的测定
3.1.1大肠杆菌的对数生长曲线
图3.1大肠杆菌的生长曲线
Figure 3.1 Growth curve of E. coli
由数据结合图3.1分析得知，大肠杆菌在经过一夜的活化后再培养，2h内就由1小时的吸光度值0.216增加到2小时的吸光度值1.38，进入对数期，在3小时到4小时左右处出现明显增长趋势。到了8小时以后曲线趋于平稳，细菌生长进入平衡期。故大肠杆菌的对数期出现在其活化培养后的3到7小时内。
3.1.2枯草芽孢杆菌的对数生长曲线
图3.2枯草芽孢杆菌的生长曲线
Figure 3.2 Growth curve of Bacillus subtilis
由数据结合图3.2分析得知，枯草芽孢杆菌在经过一夜的活化后再培养，由第3个小时吸光度值0.45长到第4个小时吸光度1.23，进入对数期，在3小时到4小时左右处出现明显增长趋势。到了7小时以后曲线趋于平稳，菌种进入稳定区。故枯草芽孢杆菌的对数期出现在其活化培养后的3到5小时内。
3.1.3金黄色葡萄球菌的对数生长曲线
图3.3金黄色葡萄球菌的生长曲线
Figure 3.3 Growth curve of Staphlococcus aureus
由数据结合图3.3分析得知，金黄色葡萄球菌在经过一夜的活化后再培养，在第4个小时时其吸光度值由0.183长到第5小时的吸光度值1.45，进入对数期，到第9小时时出现下降的趋势，故金黄色葡萄球菌的对数期出现在其活化培养后的4到8小时内。
3.2 肉桂提取物对四种菌的抑菌活性
实验使用100mm直径的培养皿，肉桂提取物和花椒提取物浓度均为800mg/ml,细菌培养基放在37℃，霉菌培养基放在28℃恒温培养20-24h后观察、测得。
3.2.1肉桂提取物对大肠杆菌的抑菌活性
肉桂提取物对大肠杆菌的抗菌活性列表为：
表3.1 肉桂提取物对大肠杆菌的抗菌活性
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.2.2肉桂提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌活性
肉桂提取物对枯草芽孢杆菌的抗菌活性列表为：
表3.2 肉桂提取物对枯草芽孢杆菌的抗菌活性
Table 3.2 Anti-microbial activity of cinnamon extract on Bacillus subtilis
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.2.3肉桂提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性
肉桂提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性列表为：
表3.3 肉桂提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性
Table 3.3 Anti-microbial activity of cinnamon extract on Staphlococcus aureus
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.2.4肉桂提取物对米曲霉的抑菌活性
肉桂提取物对米曲霉的抗菌活性列表为：
表3.4 肉桂提取物对米曲霉的抗菌活性
Table 3.4 Anti-microbial activity of cinnamon extract on Aspergillus oryzae
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.3 花椒提取物对四种菌的抑菌活性
3.3.1花椒提取物对大肠杆菌的抑菌活性
花椒提取物对大肠杆菌的抗菌活性列表为：
表3.5 花椒提取物对大肠杆菌的抗菌活性
Table 3.5 Anti-microbial activity ofpricklyash extract on Escherichia coli
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.3.2花椒提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌活性
花椒提取物对枯草芽孢杆菌的抗菌活性列表为：
表3.6 花椒提取物对枯草芽孢杆菌的抗菌活性
Table 3.6 Anti-microbial activity of pricklyash extract on Bacillus subtilis
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.3.3花椒提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性
花椒提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性列表为：
表3.7 花椒提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性
Table 3.7 Anti-microbial activity of pricklyash extract on Staphlococcus aureus
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.3.4花椒提取物对米曲霉的抑菌活性
花椒提取物对米曲霉的抗菌活性列表为：
表3.8 花椒提取物对米曲霉的抗菌活性
Table 3.8 Anti-microbial activity of pricklyash extract on Aspergillus oryzae
注:1.抑菌圈直径，不包括孔径的直径。
2.花椒的提取物浓度为800mg/ml。
3.实验中的条件为固液比为1:6，提取时间为5小时，提取温度为65℃。
3.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定
3.4.1肉桂提取物最低抑菌浓度的测定
表3.9 肉桂提取物最低抑菌浓度
Table 3.9 Minimum inhibitoryconcentration of cinnamon extract
说明：“-”表示无菌生长，“+”表示菌体生长少，“++”表示菌体生长较多。
根据表3.9可知，肉桂对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为10 mg/ml，对枯草芽孢杆菌为25 mg/ml，对金黄色葡萄球菌为10mg/ml，对米曲霉为50mg/ml。
3.4.2花椒提取物最低抑菌浓度的测定
表3.10花椒提取物最低抑菌浓度列表
Table 3.10 Minimuminhibitory concentration of pricklyash extract
说明：“-”表示无菌生长，“+”表示菌体生长少，“++”表示菌体生长较多。
根据表3.10可知，花椒对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 mg/ml，对枯草芽孢杆菌为50 mg/ml，对金黄色葡萄球菌为50mg/ml，对米曲霉为10mg/ml。
3.4.3苯甲酸钠最低抑菌浓度的测定
表3.11苯甲酸钠最低抑菌浓度列表
Table 3.11 Minimuminhibitory concentration of sodium benzoate
说明：“-”表示无菌生长，“+”表示菌体生长少，“++”表示菌体生长较多。
根据表3.11可知，苯甲酸钠对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为13 mg/ml，对枯草芽孢杆菌为9 mg/ml，对金黄色葡萄球菌为17mg/ml，对米曲霉为17mg/ml。
3.4.4苯甲酸钠与肉桂和花椒的含量换算
表3.12 苯甲酸钠与肉桂、花椒最低抑菌浓度比较
Table 3.12 Comparison of MICof sodium benzoate,cinnamon and pricklyash
根据表3.12可知，苯甲酸钠对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）要比肉桂提取物对这两种菌的最低抑菌浓度要大，对米曲霉的MIC要比花椒提取物对其的MIC要大，对枯草芽孢杆菌还是苯甲酸钠的抑菌效果要好些。
4结论
肉桂醇提取物对米曲霉的抑制作用较弱，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为10 mg/ml，对枯草芽孢杆菌为25 mg/ml，对金黄色葡萄球菌为10mg/ml，对米曲霉为50mg/ml。花椒醇提取物对大肠杆菌的抑制作用不是特别明显，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和米曲霉有较强的抑制作用，对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 mg/ml，对枯草芽孢杆菌为50 mg/ml，对金黄色葡萄球菌为50mg/ml，对米曲霉为10mg/ml。本文不仅通过试管稀释法找到了肉桂和花椒提取液对不同菌种的最低抑菌浓度，并且与化学防腐剂苯甲酸钠进行比较，可以发现对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌肉桂提取物的抑菌效果要比苯甲酸钠的抑菌效果好，所需的最低抑菌浓度要低。对于米曲霉花椒提取物的抑菌效果要比苯甲酸钠的抑菌效果好，所需的最低抑菌浓度要低。
总之，不论是肉桂还是花椒，都不仅含有丰富的营养物质，而且具有很好药效价值，如果我们将从两种重要物质中提取物的防腐作用应用于工业生产中，对于人民生活健康、药物有机利用方面都有不小的贡献。
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