PCR引物设计探讨

小志1

2015/08/04

私聊

PCR

设计引物是PCR片段扩增的第一步，而引物设计的好与坏直接决定了实验能否顺利开展，因此，设计引物这一步十分重要。目前，设计引物的方法多种多样，主要可以分为两类，一类是软件设计，最常用的的是PRIMER系列，现在已经有到版本Primer6，这一类只需将软件下载到电脑上并安装好即可离线使用。一般正版的需要付费，但是网上提供多种破译版下载。在安装好的软件上输入目的片段核酸序列，设置好扩增片段要求，引物要求，即可直接生成多对引物。另一类是在线设计，设计引物的网站有许多，一般用的较多的有NCBI，Primer 3，Primer Life，DoPrimer等等，用起来也很方便，操作基本和软件设计一致。
下面简单介绍下NCBI设计步骤：
1 打开NCBI主界面，选择右边的BLAST

2 拖到页面下方，选择Primer-BLAST

3 输入自己序列，进行引物要求设置，点击Get Primer即可获得引物

这么多种设计引物的方法，看起来设计引物是一件十分简单的事情，然而这个情况只占大部分。这是什么意思呢？首先，每一个引物设计途径能给出多对引物，并且不同途径给出的引物也不尽相同，那么该选择哪一条引物是适用的呢？其次，片段长度不同，片段结构差异对引物有不同的需求，因此，通常情况下我们通过软件可以获得有效引物，但是仍旧存在引物不可用的情况。
面对这些情况要怎么解决呢？
（1）规范操作。在设计引物参数设置时尽可能地规范，按照引物设计原则和自身要求，筛选出最好的引物。
（2）汲取经验。询问师兄师姐们，他们常用的引物设计软件是什么，不同实验室不同物种适用的软件会有差别，不能一概听信网上的推荐。
（3）多多实践。自己用不同途径设计引物，进行对照，选择最适合自身实验的方法。

引物设计好后，PCR扩增程序设定是影响引物效果的因素之一，比如退火温度过低，可能扩增出多条带或者无带等。实验过程中每一步都很重要，所以做实验的需要有耐心和细心，实验才能顺利进行下去。