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个人PCR方法记录

菜菜2

2015/09/17

在实验室两年了，大部分时间都在PCR片段扩增，PCR这项技术几乎是所有实验的基础。比如大肠杆菌转化后菌落挑斑检测要用到；酵母双杂中基因筛选要用到；基因型检测要用到；基因表达分析要用到等等。掌握好这项实验技术，实验会有事半功倍的效果。
输入“PCR”搜索，网上都有都有详细的原理介绍以及方法操作步骤，不过不同实验室在操作步骤上会有不同。以下是我个人的实验操作方法，记录下来算是自己做个总结归纳，也供初进实验室的人借鉴一下。
1 引物设计。根据需要扩增的目的基因序列，利用软件设计特异性引物。引物设计一般分为软件设计和在线设计两种。引物设计软件一般用的是Primer 5，在线设计则是在NCBI上，另外在所做物种的专门的网站上也可以设计及利用本实验室的内部服务器设计。
2 引物合成。这一部分是交给公司。普通的引物纯化方式采取HAP方式，如果有要求的话可以采取其他方式。
3 引物溶解。因为引物是微小的颗粒状粉末，溶解前最好先离心，再加灭菌ddH2O溶解。加水量根据所需引物浓度要求而定，通常是10uM和5uM。如需马上使用的话在37度水浴锅中水浴10min即可，不着急使用在常温下溶解1个小时左右即可。溶解后放于冰箱4度保存。
4 PCR体系配置。一般PCR体系包括DNA模板，引物，聚合酶，聚合酶buffer，和灭菌水。现在配置体系很方便，公司将聚合酶和聚合酶buffer配置成Mix，Mix的扩增效果能满足一般的PCR需求。在使用相应的Mix的时候，会配有说明书，按照说明书要求配置体系即可，当然有时可根据需要自行调整。但是，有些片段用普通的Mix无法进行扩增，这时则需要使用高效扩增酶，当然，价格也比普通的聚合酶高出不少。配完之后，加一层矿物油保护反应体系，避免PCR仪加热时体系被蒸干。
5 PCR反应。第一步变性温度有用95度，有用94度的，变性时间5到10分钟不等，我习惯用95度5分钟，酵母检测则用95度10分钟。退火温度根据引物要求设定，延伸时间根据扩增片段长度设定，1Kb延伸时间1分钟。为了保护PCR仪，最后一步不能设置成无穷。
上面就是简单但是又很重要的PCR方法操作，PCR反应完了之后则可以进行后面的操作了，琼脂糖电泳或者聚丙酰胺凝聚电泳，DNA回收等等的了。
就这么多了。欢迎大家一起交流。

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又又1990

第1楼2015/09/18

感谢楼主来分享，期待更多的作品

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元业东方

第2楼2016/05/31

感谢楼主分享，北京元业东方微博正式成立生命科学仪器维修包括分子生物学细胞生物学所涉及的所有仪器。专业维修国内进口各种Pcr[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp]基因扩增仪，电泳转印系统，离心机，摇床，凝胶成像，恒温孵育，灭菌锅等可上门维修，找不到厂家不要紧，一个电话就可以18622005498

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dbdx990511

第3楼2016/06/01

没看明白，不是之一行的，感谢楼主分享。

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