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【生活中分析】+【8888】+色谱柱在检测中的核心地位

jhjs

2015/08/15

色谱柱在检测中的核心地位

色谱法是一门色谱分离与分析技术的分析方法。色谱分离的核心元素是流动相与固定相，固定相就是我们通常所说的色谱柱（具体指的是色谱柱中的填料）。样品随着流动相进入到色谱柱，流动相和固定相之间连续、不间断发生着某种（或某些）作用力，比如吸附-解吸-再吸附-再解吸等。不同样品受这种作用力的影响程度不同，从而达到分离。
色谱柱是高效液相色谱最核心的部件，在液相色谱检测中（起分离作用）的作用不言而喻，下面我们就以高效液相色谱法检测自来水中草甘膦含量为例加以说明。
草甘膦是一种广谱除草剂，在现代化农业生产中被大量使用。它常温下比较稳定，残留物严重污染了水质、土壤、草料、粮食等，同时也存在畜牧产品和粮食加工品中。其中在各种水质、水源中存在比较广泛和严重。水质污染影响着我们的生存、生活，检测尤为重要。
现在草甘膦检测方法主要有气相色谱法、气质色谱法、液相色谱法（包括荧光检测法和紫外检测法等）等。
下面我们以高效液相色谱法检测自来水中草甘膦含量并以此为例来说明色谱柱在检测中的核心作用。
现在能检测草甘膦的色谱柱一般都是专用色谱柱，很多厂家都有生产。通过大量实验我们找到了两款非常优秀的色谱柱，一款是紫外检测法用的天津博纳艾杰尔科技有限公司生产的Venusil SAX 色谱柱，另一款是荧光检测法用的美国美瑞泰克科技有限公司生产的Pickering阳离子交换色谱柱。国标GBT 5750.9-2006 生活饮用水标准检验方法中提到了阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法，其中阴离子交换色谱法检测效果一般，且色谱柱已不好找到，所以该类样品检测现在主要采用阳离子交换色谱法。
下面我们先介绍下高效液相色谱荧光检测法（该方法需要柱后衍生）检测自来水中草甘膦。
原理
精密量取适量自来水样品经过滤、浓缩等前处理处理后注入高效液相色谱系统，经流动相磷酸二氢钾溶液洗脱，在色谱柱中分离。分离后的样品在经过柱后衍生系统反应，生成反应产物经荧光检测器检测。外标法（保留时间定性，峰面积定量）分析计算。
柱后衍生与荧光检测器结合使得本方法具有很高的灵敏度和选择性，因而被广泛使用。
设备
高效液相色谱仪（梯度泵1套+柱温箱+柱后衍生仪+衍生注射泵2台+荧光检测器+数据采集器+草甘膦专用阳离子交换色谱柱+色谱工作站等），超声波清洗仪，溶剂过滤器，固相萃取装置，离心机，浓缩仪（恒温水浴或氮吹仪），电子天平等。
材料及试剂
磷酸二氢钾（分析纯）；磷酸、硫酸、盐酸（分析纯）；氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钠（分析纯）；次氯酸钠（分析纯）；硼酸钠（分析纯）；OPA（邻苯二醛，色谱纯）；MERC（2-巯基乙醇，优级纯）；甲醇（色谱纯）；超纯水；草甘膦标准品，纯度≥99%；氨甲基膦酸标准品，纯度≥99%等。
试剂和标准品的准备
氧化试剂(衍生试剂1):
取0.5g次氯酸钠溶解于500ml超纯水中，搅拌，待完全溶解，作为储备液。取10ml次氯酸钠储备液于1L容量瓶中，加入1.74g磷酸二氢钾，11.6g氯化钠，0.4g氢氧化钠，加水稀释，定容，旋转，混匀，0.45um水系滤膜过滤，超声波超声脱气15min，备用。
OPA试剂(衍生试剂2):
将100g硼酸和72g氢氧化钾置于1L容量瓶中，加700ml超纯水溶解（完全溶解需1-2小时）。加入含0.8g OPA的甲醇溶液5ml，加入MECR 2.0ml，旋转，混匀，0.45um有机系滤膜过滤，超声波超声脱气15min，备用。
注意：加入OPA和MECR试剂步骤应在尽可能短的时间内完成，因为此试剂对氧气和光敏感。此衍生试剂为荧光标记溶液，OPA和MECR试剂为荧光标记试剂，它们两种试剂的质量和配置一定得保证。
样品前处理这就不多介绍了，具体可参考《GBT 5750.9-2006 生活饮用水标准检验方法农药指标》中草甘膦检测部分。
色谱条件
检测器：荧光检测器
分析柱：草甘膦分析柱，Pickering阳离子交换色谱柱，4 mm x 150 mm ，8um
保护柱：草甘膦保护柱，Pickering阳离子交换保护柱，3 mm x 20 mm ， 8um
柱温：55℃
流动相：(A)磷酸二氢钾（5mmol，磷酸调pH 2.0）；(B)氢氧化钾（5mmol）
流速：0.5 mL/min
衍生试剂1：氧化试剂，36℃，流速为0.5mL/min
衍生试剂2：OPA-MERC试剂，室温，流速为0.4mL/min
荧光激发波长：330nm，发射波长：460nm
进样量：20ul
剃度表：

序号
时间（min）
A（%）
B（%）
1
0
100
0
2
15
100
0
3
15.1
0
100
4
18
0
100
5
18.1
100
0
6
25
100
0

标准品色谱图：

某自来水样品色谱图：

有人可能会问，不是检测草甘膦吗，怎么还检测氨甲基膦酸呢。大家可以看前面有一种衍生试剂叫氧化试剂，它是把没有荧光效应的草甘膦氧化成了氨基乙酸（又叫甘氨酸）和氨甲基膦酸，氨基乙酸通过荧光标记物衍生试剂衍生，会具有很强的荧光效应。如果草甘膦被完全氧化的话，氨基乙酸的摩尔数量就等于草甘膦的摩尔数量，用氨基乙酸的色谱峰假设成草甘膦的色谱峰，利用其就可以准确的计算出样品中草甘膦的含量，因此可以把氨基乙酸色谱峰叫做草甘膦色谱峰。而氨甲基膦酸在这个过程中是必然存在的，它的色谱峰是肯定有的，只是在这它不是检测物，因此图谱上它一定存在，但我们不会去计算它。
这个方法检测自来水中草甘膦，具有检出限非常低，线性良好且范围宽，重复性好，回收率高等众多优点，检测结果准确、可靠，是该类样品检测的理想方法。
做过该类样品（含草甘膦的样品）检测的同僚们都知道，这类样品检测大多选用荧光检测法，难度较大。一是对氧化试剂要求高，它必须把样品中（包括标准品）草甘膦完全氧化；二是对荧光标记试剂要求也非常高，包括标记试剂OPA和MERC的质量和试剂的准确配置，否则要不不出峰，要不出峰不准确；三是需要仪器配置特别高，不仅需要梯度洗脱装置，还需要衍生仪和双衍生注射泵；四是自来水样品（或其它样品）中草甘膦含量一般很低，这就需要浓缩或富集样品，一般需要处理的量还比较大；五相当重要，是这个实验成败最关键的因素之一，那就是色谱柱的选择。只有选择了色谱柱才能选择流动相，才谈得上样品分离。在这个方法中现在荧光检测器用的色谱柱绝大多数都是离子交换色谱柱（这种色谱柱使用荧光效应低的酸碱盐流动相，也就是色谱背景低，检测具有灵敏、稳定、准确等优点）。而大多的离子交换色谱柱（也包括离子对等离子色谱柱）不能用含有有机试剂的流动相，离子色谱柱用的填料是聚合物树脂，有机试剂可能会溶解或破坏这种树脂结构，所以如果采用国标GBT 5750.9-2006中的流动相（0.68g磷酸二氢钾溶于1L 4%的甲醇水溶液中，用磷酸调节PH值为2.1），这款色谱柱（大多离子色谱柱）绝对不能用。
色谱柱在色谱中起的分离作用是色谱中核心部分，在这个实验中所需的色谱柱又是非常专业的，也是非常昂贵和不好选的，所以这款色谱柱在这个检测方法中具有着绝对核心的地位。

下面我们介绍下高效液相色谱相对简单的紫外检测法检测自来水中草甘膦。

原理
取自来水样品适量，经过滤、浓缩等前处理处理后注入高效液相色谱系统，经Venusil SAX色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法（保留时间定性，峰面积定量）计算。
仪器
高效液相色谱仪（高压泵＋紫外检测器＋柱温箱＋Venusil SAX色谱柱＋色谱工作站等）；超声波清洗仪，溶剂过滤器，固相萃取装置，离心机，浓缩仪（恒温水浴、或氮吹仪），电子天平等。
试剂
甲醇（色谱纯）；磷酸二氢钾（分析纯）；硫酸（分析纯）；超纯水等。
样品前处理和上面的一样，这就不多说了。
色谱条件
检测器：紫外检测器
检测波长：195nm
色谱柱：Venusil SAX （4.6 mm x 250 mm 5um，100A）色谱柱
流动相：甲醇：0.1mol磷酸二氢钾（磷酸调PH=3.0）=8:92（V：V）
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：20ul
标准品色谱图：

某自来水样品色谱图：

该方法的色谱柱也是专用的，实验前也得先选色谱柱，再根据色谱柱特性选流动相，好在流动相组成一般都是甲醇和磷酸二氢钾混合溶液，只是各成分比例随不同规格、厂家的色谱柱而有所不同。而检测波长又随着流动相不同又有可能不同，检测波长尽量选择草甘膦响应值高而背景低的波长。这个大多供货厂家都有具体使用条件，买色谱柱时都会提供。
小结：紫外检测器检测自来水样品中农药残留草甘膦，具有检出限低（但远不如荧光检测器检出限低），方法线性好、重复性好、方便、准确、可靠等优点，适用于草甘膦该类样品（含草甘膦的样品）检测。
以上这两种方法都可以检测自来水中农药残留草甘膦，效果都很好，各有优缺点，各有侧重点。其中选择一款优良的色谱柱在这两种方法中都起着至关重要的作用。色谱柱在这两种方法中都占有核心地位。
说明
1．采用高效液相色谱法荧光检测器检测自来水中农药残留草甘膦（也包括其它具有荧光效应的样品）含量，最大的优点是检出限低；不足之处是仪器配置复杂，实验方法复杂，所有的试剂多，实验费用高等。所以荧光检测器更适合检测含量较低的样品。
2．采用高效液相色谱法紫外检测器检测自来水中农药残留草甘膦含量最大的优点是仪器配置相对简单，实验方法相对简单，实验费用相对较低，稳定性、线性相对较好等；不足之处是检出限远不如荧光检测器低，含量低的样品需浓缩的程度更多等。所以紫外检测器更适合检测含量较高的样品。
3．实验中一定要选择一款专用色谱柱，色谱柱选的好，实验就会做的好。如果实验中的您为不知如何选色谱柱而苦恼，不防选以上色谱柱和方法试试。
4．国标方法有时只作参考，切不可完全模仿。
5．以上两种方法检测该类样品效果都很好，但各有优缺点。实验时可根据实验室、被测样品及实验要求等具体情况选择更佳理想的检测方法，争取实现检测结果准确、可靠，省时、省力、省费用的完美效果。

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名字长了容易引起注意

第1楼2015/08/16

应助达人

写的非常不错，虽然我不是看的很明白

0

大陆

第2楼2015/08/19

专用色谱柱、根据实验室与被测样品及实验要求等具体情况调整国标方法达到目的……都是宝贵经验啊。赞。

0

reqwr124

第3楼2015/08/23

这个是农药还是什么？

0

jhjs

第4楼2015/08/23

属于农药残留
reqwr124(reqwr124) 发表:这个是农药还是什么？

0

不怕高

第5楼2015/08/23

是除草剂的一种，属于农药
reqwr124(reqwr124) 发表:这个是农药还是什么？

0

sgxy

第6楼2015/08/26

经验往往能指导实践

0

sgxy

第7楼2015/08/26

现在草甘膦在蔬菜上的残留还是很常见的

0

sgxy

第8楼2015/08/26

农田离不开除草剂，用量是很可观的

0

透明

第9楼2015/08/26

高效液相色谱法那么复杂啊

0

jhjs

第10楼2015/08/26

其实是确实是，污染也是很严重的
sgxy(sgxy) 发表:农田离不开除草剂，用量是很可观的

0

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