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高效液相色谱仪与超高效液相色谱仪因样而选因人而宜

langyabeilei

2015/08/20

液相色谱（LC）

近些年来，随着科技的飞速发展，液相色谱技术应用也逐渐步入快车道，沃特世、岛津、安捷伦、戴安等分析仪器知名公司都相继研发成功并将最新的的超高效液相色谱仪推向市场，业界内外纷纷一味追求高精尖，追逐快速高效，殊不知液相色谱类仪器并非一味追求快速，而是好比谈恋爱，要看是不是适合自己的工作要求，这其中难免就会涉及到分析项目、分析精度以及工作成本等等一系列因素，本文就自己心得以及所学在此做与大家一起来探讨交流：
首先，众所周知，高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有异极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入不同类型的检测器进行检测，从而实现对样品的定性定量分析。而超高效液相色谱与高效液相色谱原理基本相同，不同之处就是：1、色谱柱发生了变化小颗粒高性能微粒固定相出现，2、流动相超高压输液泵出现 3、采集速度更快的检测器出现，主要因素就是基于这三点。但是，超高效液相色谱仪并非针对每一种分析样品，每一种分析化合物都如此高效快速，必须因样而选，否则的话，就会适得其反，事倍功半，前功尽弃。

笔者单位去年采购一台 Waters ACQUITY UPLC H-CLASS，在国内环境监测业界还算是高大尚的液相色谱仪器，根据介绍可以实现：无需更改现有工作流程即可获得UPLC性能灵活和简便的四元溶剂混合和直接注射取样完美兼容HPLC方法，无缝转换至UPLC方法方法转换包可保证分离方法的一致性，流速范围0.010 ~ 2.000 mL/min，以0.001 mL增速步进，最高操作压力：15,000 psi最高到1 uL/min，9,000 psi最高到2 mL/min，据于此类性能，加之单位以前有一台服役多年面临脱保的安捷伦LC-1100，可以接班服役，同时提高工作效率，不必再劳神费心，一个样品等待大把时间，因此，趁着还在维保范围内，迅速入手，希望短时间之内形成"作战“能力，投入实战。
恰逢迪马科技在论坛搞一个色谱柱试用活动，遂参加尝试用液相色谱法分析水中苯系物，以做直观比较：色谱柱型号：迪马 DiamonsilPlus （固定相)，250mm（柱长）4.6 mmx5 μm色谱柱型号：Agilent Eclipse PAH固定相)，250mm（柱长） 4.6 mm x 5 μm WATERS XBridge C18 250mm（柱长）4.6 mmx 5 μm 以及 UHPLC WATERS 50mm(柱长)2.1mm x 1.7 μm，其中HPLC分析条件如下：
流动相：甲醇：水= 65： 35 (如有梯度请注明梯度表)
流速： 1.0 mL/min
柱温： 40 ℃
检测器： UV 260 nm 或其他检测器
进样量： 10 μL

分析结果如下：
Diamonsil Plus谱图

Agilent Eclipse PAH

WATERSXBridge C18

上述结果分析：分析比较:Diamonsil Plus与Agilent EclipsePAH WATERS XBridge C18所分析谱图比较：前者为甲醇中的六中苯系物谱图，后者为二硫化碳中的苯系物，其他条件相同，前者流速为1mL/min进样量为20ul，后者流速为0.5mL/min进样量为5ul，通过比较可以基本得出如下结论：Diamonsil Plus 可以承受大进样量的化合物分析，柱效表现良好，在20/5的情况下，峰形保持较好；Agilent Eclipse PAH专用柱可以将六种苯系物进行分离，但是部分化合物分离度表现不好，喜忧参半，WATERS XBridge C18 柱效比较好，表现中规中矩，没有优缺点。
总之，下步还需要开发合适的分析方法进行验证，目前正在常使用UPLC H-class进行方法开发,请推荐比较好的UPLC色谱柱应用。遂用UPLC 来分析需要进行HPLC方法，无缝转换至UPLC方法，直接选择方法修改器进行修改：修改后条件：UPLC 1、（考虑粒度)分析用时：1.68min 流速为0.61mL/min 进样量0.4 μL 2、（不考虑粒度）分析用时：4.94分钟流速：0.208mL/min 进样量:0.4μL ,按照分析条件1设置后操作，进样后稍许时间，仪器就开始高压报警，遂紧急停止进样，终止运行，查找原因未果，咨询800后给出解释，进样量一般控制在0.5mL/min以内，一头雾水，为什么？有因有果，最从原理入手查找：后来发现原来如此：根据VanDeemter方程推论可以得出色谱柱的长度与出峰时间称正比，与泵的流速成反比，同时泵的压力也与流量成正比，这样的话，流速一般要是按照仪器最高限运行的话，越需要更高的耐高压，而恰恰相反流量增大的情况下，UHPLC的耐高压能力在下降，似乎这就解释了为什么按照方法修改器修改的方法不能够正常就需运行，必须调低流量，然后问题解决掉了，实验继续，待进样运行以后，分析速度很快，用时缩短很多，但是分离度确实不能让人接受，明明HPLC基本可以分离的化合物在UHPLC确实完全不能分离，基本快成一个大包峰出现，后来查找原因发现，提高分离度只有增加色谱柱的长度，而本款无法使用250mm的色谱柱，因为柱温箱无法安装只能作罢，只能在下一步的分析中找填料粒径更小的固定相，试验到此，我已经很疲惫了，遂写此文与大家分享。
总之，写本文的目的不是说高精尖的分析测试仪器不能带动科技的发展进步，只不过是告诉大家要针对自己的工作特点和分析测试的项目不同，谨慎选择所需要的仪器设备，做足事前筹划，才能够保证事后不后悔，也杜绝高费用购入，低档次运行，真正实现资源高效可持续运行，为自己的分析测试工作真正插上一对飞翔的翅膀。

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浪淘沙隐

第1楼2015/08/20

做对比的时候，色谱柱填料考虑了吗？

0

langyabeilei

第2楼2015/08/20

应助达人

都是C18填料
浪淘沙隐(zhoujin83) 发表:做对比的时候，色谱柱填料考虑了吗？

0

老多_小多

第3楼2015/08/20

我很同意楼主最后的一段话，这样仪器的利用率才高

0

johnblacke

第4楼2015/08/20

我只能对楼主呵呵了。

0

colindrj

第5楼2015/08/21

拿hclass做环境中的苯系物，杀鸡用牛刀还觉得没有高费用购入，低档运行。。。
我也只能呵呵。。。
随便找个福立的气相做不就完了。

0

langyabeilei

第6楼2015/08/21

应助达人

老师啊，高精尖仪器不仅仅可以做高端也可以做低端吧，不能说是高效液相色谱可以基本分离的化合物，换到超高效液相色谱上就失灵了，而且两者原理基本一致，难道不需要提出一些建议让研发者引起注意吗？不要一味追求高技术，要兼顾而为之，同时让采购使用者一个建议，莫追求高精尖，适合自己最重要！我说的不为过吧！
colindrj(colindrj) 发表:拿hclass做环境中的苯系物，杀鸡用牛刀还觉得没有高费用购入，低档运行。。。
我也只能呵呵。。。
随便找个福立的气相做不就完了。

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浪淘沙隐

第7楼2015/08/21

C18也有很多种，难道不考虑色谱柱之间的差异就直接说方法不能转移？

0

小不董

第8楼2015/08/21

应助达人

虽然都是C18柱，但还是有差别，不能仅仅从色谱图来分析，我们考虑更换液相，也在考虑选择超高液相还是用高效液相。
一个是价格问题，柱子耗材，试剂耗材，操作方便，开发方法等，多个因素都需要考虑。

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langyabeilei

第9楼2015/08/21

应助达人

恩，只不过有时超高效液相色谱比如我们使用的这一款，有很多苦恼，不能再用以前高效液相色谱柱，但是呢流量还不能太大，否则压力报警，但是呢以前高效液相色谱柱完全可以承受那些压力和流速，真是麻烦？哎，苦恼！还是老款好用！
小不董(doxw0323) 发表:虽然都是C18柱，但还是有差别，不能仅仅从色谱图来分析，我们考虑更换液相，也在考虑选择超高液相还是用高效液相。
一个是价格问题，柱子耗材，试剂耗材，操作方便，开发方法等，多个因素都需要考虑。

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浪淘沙隐

第10楼2015/08/21

根据我以前的经验，UPLC完全是可以用0.8ml/min的流速的，但是需要慢慢的提高流速，而不能直接从0提升到需要的流速。

0

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