使用SPE小柱检测辣椒油树脂中的辣椒素

huter9981

2015/09/16

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使用SPE小柱检测辣椒油树脂中的辣椒素

实验目的
辣椒油树脂是用有机溶剂浸提红辣椒粉后的滤液经浓缩所得油状物，是辣椒红色素和辣椒素的混合物。辣椒红色素属于类胡萝卜素，具有抗氧化，抑制肿瘤等生理活性的天然红色素。辣椒油树脂产品的商用价值非常可观。评价其品质很重要的就是其辛辣程度，因而辣椒素的测定已成为辣椒油树脂品质鉴定必须进行的项目。辣椒素（Capsaicinoids）是辣椒中的辛辣成分，属于酰胺类化合物，是辣椒碱类化合物的总称，其主要成分有三种，辣椒碱（Capsaicin）,二氢辣椒碱(Dihydrocapsaicin),降二氢辣椒碱（Nordihydrocapsaicin）,占辣椒素含量的98%左右。对于辣椒油树脂中辣椒素的测定，传统的萃取方法要经过水浴，超声波提取，浓缩后进行色谱分析。该法处理样品的缺点是操作繁琐，费时，不利于批量检验。我们尝试用溶剂稀释法处理，即辣椒油树脂用乙醇溶解后，溶液经0.45微米滤膜后，直接上机，进行色谱分析。该法虽然操作简便快速，但因样品未经净化处理，污染了色谱柱，严重影响色谱柱的使用寿命，仪器的流路系统也受到了污染。为此必须找到一种更好准确快速的方法。我们使用固相萃取（SPE）的前处理技术提取辣椒油树脂中的待测目标化合物。取得了满意的实验结果

1. 实验方法

1.1仪器和试剂

高效液相色谱仪（岛津LC_16），荧光检测器（岛津RF_20A），色谱柱（Athena C18-WP, CNW）,CNWONDLC-C18 SPE小柱(CNW）

乙腈（HPLC级，CNW）, 水（HPLC级），95%乙醇（分析纯），丙酮（分析纯），甲醇（分析纯），合成辣椒素标样（N-Vanillynonanamide,N-壬酸香草酰胺 96%，上海安谱供应）

1.2 色谱条件

流动相（V乙腈:V水）=60:40, 流速1.5ml/min, 色谱柱C-18(5 μm,15cm×4.6mm),

柱温35℃，荧光检测器激发波长280nm, 发射波长325nm,，进样量20μl

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制精密称取150mg合成辣椒素(N-Vanilly-n-nonamaide)于100ml烧杯内，加入少量95%乙醇溶解，将溶液转入200ml容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，作为标准贮备液。取标准贮备液用95%乙醇稀释成浓度为0.010mg/ml,0.025mg/ml,0.040mg/ml,0.060mg/ml,0.075mg/ml的工作标准溶液，溶
液经0.45微米滤膜过滤，待用。
1.3.2 样品的前处理
1.3.2.1样品提取精密称取1-2g辣椒油树脂于50ml容量瓶中,加入约5ml丙酮淋洗容量瓶的内壁，摇匀，使辣椒油树脂充分溶解。再用95%乙醇定容至刻度，摇匀。
选用CNWOND LC-C18SPE
小柱, 活化：加入5 mL
甲醇，流出液弃去；
平衡：加入5 mL去离子水，流出液弃去；
吸取5.0ml提取液作为上样液待净化，收集流出液
洗脱：加入3×5 ml95%乙醇，收集流出液，合并步骤3 的流出液收集于25ml容量瓶。
用95%乙醇定容至刻度，摇匀。此溶液经0.45微米滤膜过滤，待用。
1.3.2.3上机，进行色谱分析
1.3.3 精密度实验称取辣椒油树脂5份，按1.3.2方法和1.2色谱条件处理和测定，计算精密度 RSD%=S/X。
1.3.4 回收率实验将已知浓度样品溶液与标样溶液（溶剂：95%乙醇）混合并定容。
按1.3.2方法和1.2色谱条件处理和测定，按公式：（实测值-样品所含辣椒素）/加入的辣椒素）×100%计算回收率。
2. 结果分析及讨论
2.1标准曲线的绘制
取0.010mg/ml,0.025mg/ml,0.040mg/ml,0.060mg/ml,0.075mg/ml的工作标准溶液按1.2色谱条件，分别以20μl进样，以辣椒素浓度（mg/ml）为橫坐标，色谱峰的面积为纵坐标绘制标准曲线。（见图2）其回归方程为y=3E+07x+12261 R=0.9997,浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系。
标准品（辣椒素）色谱图如图1所示，其保留时间为15.04min。

图1 辣椒素标准曲线标准品色谱图

浓度（mg/ml）	0.010	0.025	0.040	0.060	0.075
面积（mv.s)	350781	876905	1405866	2004187	2630120

表1 辣椒素浓度与色谱峰面积

图2 辣椒素标准曲线

2.2 辣椒油树脂样品中辣椒素的测定
样品中辣椒素的色谱图如图3所示，在保留时间 13-24min出现的三个峰，与杂质获得很好的分离，保留时间分别为13.742min,15.357min,22.891min，样品图谱中各辣椒素的判定根据其各自的相对保留时间来判定: 降二氢辣椒素（Nordihydrocapsaicin）： RRT=0.92；辣椒素（Capsaicin）： RRT=1.02合成辣椒素(N-Vanilly-n-nonamaide)：RRT=1.00；二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin)： RRT=1.52，三个峰的保留时间与标样色谱图的保留时间很吻合，可以断定样品图谱中的这三个峰分别代表降二氢辣椒素（Nordihydrocapsaicin）,辣椒素（Capsaicin）,二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin)。