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人免疫球蛋白F c段 生物学活性测定法

化学药检测

  • 一、原理:本法系依据特异性抗体(免疫球蛋白)F a b段与红细胞上已包被的相应抗原结合,抗体暴露出F c段补体Clq的结合位点,从而激活后续的补体各成分,最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂,释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲线,计算人免疫球蛋白激活补体活性的功能指数(4 ) ,以此测定供试品F c段生物学活性。
    二、试剂
    (1) P B S (pH7.2) 称取无水磷酸氢二钠1.02g,无水磷酸二氢钠0.34g、氣化钠8.77g,加适量水溶解,用lmol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调p H 值至7.2,再加水稀释至1000ml。
    ( 2 )钙-镁贮备液 称取氯化钙1.10g、氯化镁5. 0 8 g ,加水25ml使溶解。
    ( 3 )巴比妥-钙镁贮备液称取氯化钠51.85g、巴比妥钠6.37g,加水1000ml使溶解,加人钙-镁贮备液3.125ml,用lmol/L盐酸溶液调p H 值至7. 3,再加水稀
    释至1250ml。除菌过滤后4°C保存备用。
    ( 4 )牛白蛋白-巴比妥缓冲液称取牛血清白蛋白0. 15g加入巴比妥-钙镁贮备液20 m l中,加水溶解并稀释至100ml。临用前配制。
    (5) 1. 3mg/L 鞣酸 P B S (pH7. 2) 溶液A 液称取鞣酸l m g ,加PBS (pH7.2) 10ml,使溶解。
    B 液量取 A 液 0.1ml,加 F*BS (pH7. 2) 7.5ml,混匀,即得,临用前配制。
    (6) 10%氯化铬溶液称取氯化铬5g,加生理氯化钠溶液50ml使溶解。4°C保存(可保存半年)。
    (7) 1 % 氯化铬溶液取1 0 %氯化铬溶液0. lml,加生理氯化钠溶液0.9ml,混匀。临用前配制。
    (8)敏化红细胞的制备
    A 液取健康人抗凝的O 型血3 人份以上混合,用P B S 洗涤3 次,最后一次以每分钟2 0 0 0转离心1 0分钟分离红细胞。取适量压积红细胞悬浮于1 . 3 m g / L鞣酸P B S
    (1 : 4 0 ) , 置3 7 ° C水浴中轻摇3 0分钟后再用P B S 洗涤3次,最后用P B S 制备成2. 5 % 红细胞悬浮液。
    B 液用P B S适当稀释的白喉类毒素或腮腺炎病毒与1 % 氯化铬溶液0.25ml混合(1 0 : 1 ) 后,置37°C水浴中轻摇1 5分钟。
    将A 液、B 液按1 : 4 混合,置37°C水浴中轻摇3 0分钟。离心,去上清液,用P B S将沉淀(敏化红细胞)洗涤3 次,用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞,调节至
    适宜浓度,使其在波长5 4 1 n m处的吸光度为1.0土0. 1。
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  • 青林

    第1楼2015/09/26

    (9)参考品溶液的制备用lmol/L氢氧化钠溶液将参考品p H 值调节至6. 8?7 . 0,再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将参考品I g G浓度稀释至每l m丨含40mg。
    供试品溶液的制备用lmol/L氢氧化钠溶液将供试品p H 值调至6. 8?7.0,再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品I gG浓度稀释至每lml含40mg。
    三、测定法:取供试品溶液0.9ml,加敏化红细胞悬液0.1ml,混匀,置37?C水浴中轻摇3 0分钟。离心,去上清液,用牛白蛋白-巴比妥缓冲液lml洗涤红油胞,共洗3次。末次离心后弃上清液800^1,向沉淀中加人600^1预热到37?C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液,充分混匀,2 分钟后再加入已稀释至每lml含150 C H 5。的补体200^1,混匀后立即照紫外-可见分光光度法(通则0401) 在波长54 1 n m处测定起始吸光度(A s),之后,每隔1 分钟测定1 次,即得供试品在波长541mn处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量。分别取参考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)0.9ml,自“加敏化红细胞悬液0. lml”起,同法操作。按公式(1 ) 分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2) 计算供试品激活补体的功能指数(& ) ,应不低于国家参考品活性的60%。

    以上内容是药典的内容的。大家不要在意。

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  • 青林

    第2楼2015/09/26

    仪器:UV-2450紫外可见光谱仪
    模块:动力学
    时间间隔:0.1min,自动。
    时间:20min

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  • 青林

    第3楼2015/09/26

    四、结果与讨论
    1、经过准确度与重复性试验,准确度为75%-125%,重复性为5.6%,还有提高的可能。
    2、在试验过程中,补体的效价有一定的关系(保密),能达到最好结果。
    3、类毒素的品质对试验结果至关重要。

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  • 青林

    第4楼2015/09/26

    希望大家给点建议,谢谢大家对我的支持

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  • 荆棘鸟fiona

    第5楼2015/09/27

    最好汇总到主题帖的说~~

    青林(wyqql2060) 发表:希望大家给点建议,谢谢大家对我的支持

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  • 土老冒豆豆

    第6楼2015/09/27

    应助达人

    原来青林搞生物制品这么高科技的啊。

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  • 青林

    第7楼2015/10/10

    这次一定注意

    荆棘鸟fiona(v2648817) 发表: 最好汇总到主题帖的说~~

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  • 青林

    第8楼2015/10/10

    这是试验的任务,没办法

    土老冒豆豆(土老冒豆豆) 发表:原来青林搞生物制品这么高科技的啊。

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