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ＶＩＩＩ因子氨基酸含量测定之：组氨酸与甘氨酸快快分开！

青林

2015/09/26

化学药检测

本人在8月发表的一篇原创中提及”甘氨酸与组氨酸无法分离“的问题，在经过10多天的准备，已有不小的收获，现在分享。
摘要目的: 建立用高效液相色谱法测定人凝血因子VIII中氨基酸含量。方法: 采用6 －氨基喹啉－ N －羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 为衍生剂，与氨基酸柱前衍生后，用Agilent 1200 高效液相色谱仪，AccQ·Tag C18柱( waters 150 mm ×3. 9 mm，4 μm) ，以水Eluent( 醋酸盐－磷酸盐缓冲液) 稀释液和乙腈进行梯度洗脱，检测波长为248 nm，柱温37 ℃，进样量10μL。结果: 各氨基酸在32 min 内测定完毕，回收率为98.7% ～ 101.5%。RSD 均小于1. 5%。结论: 本法分离度好，快速、简便，可作为产品的质量控制方法。
关键词: 6 －氨基喹啉－ N －羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯; 人凝血因子VIII; 甘氨酸; 衍生物; 梯度洗脱; 高效液相色谱法;氨基酸; 含量测定
人凝血因子VIII，本品对缺乏人凝血因子礓所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。
该药物制备过程中使用了氨基酸( 精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、盐酸赖氨酸、脯氨酸等) 做稳定剂，为了保证药品质量和用药安全，应对其中氨基酸的含量进行控制。该法依据过量的6 －氨基喹啉基－ N －羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 在一定条件和氨基酸形成稳定的衍生产物( 柱前衍生) ，用高效液相色谱法测定衍生产物，根据衍生产物的含量计算人凝血因子中各氨基酸的含量。

1 仪器和试药
1200 高效液相色谱系统( 美国Agilent 公司) ，配置低压四元梯度泵、1314B 紫外吸收检测器、自动进样器、柱温箱、Chemistations 化学工作站; Sartorius CP225D 电子微量天平( 德国Sartorius 公司) ; SartoriusPB － 21 型pH 计( 德国Sartorius 公司) ; LDZ5 －2 低速自动平衡离心机( 上海医用离心机厂) 等。

各标准品均来自于中国食品药品检定研究院

2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱: Waters AccQ·Tag C18色谱柱( 3. 9 mm ×150 mm) ; 流动相: 水为溶剂D，Eluent( 醋酸盐－磷酸盐缓冲液) 稀释液( A) －乙腈( B) －水( D) ，柱温:37 ℃; 检测波长: 248 nm。精密量取对照品溶液与供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图32 min。
3 溶液制备
3. 1 Eluent( 醋酸盐－磷酸盐缓冲液) 稀释液称取三水乙酸钠190. 4 g，加注射用水1000 mL，搅拌，溶解，用稀磷酸将pH 调至5. 2，加入乙二胺四乙酸二钠溶液( 称取乙二胺四乙酸二钠100 mg，加注射用水100 mL，摇匀使其溶解) 10 mL，加入叠氮化钠0. 1 g 及三乙胺23. 7 mL( 17. 2 g) ，用稀磷酸滴定至pH 4. 95，用0. 45 μm 的滤膜过滤，于4 ℃储存，备用( 此条件下可保存6 个月) 。量取该溶液100 mL，加注射用水稀释至1000 mL，混匀，即得Eluent( 醋酸盐－磷酸盐缓冲液) 稀释液。
3. 2 对照品储备液混合对照品储备液精密称取各氨基酸对照品适量，置同一100 mL量瓶中，以注射用水溶解并定容至刻度。制成含氨基酸含量均含5. 0 mg·mL － 1 的混合对照品溶液，即得。
单个对照品储备液: 精密称取各含氨基酸的各对照品适量，分别置100mL 量瓶中，用注射用水溶解并定容至刻度。制成分别含各氨基酸的单个对照品溶液，即得。
3. 3 供试品储备液
3. 3. 1 加样回收率试验溶液精密称取各氨基酸各0. 3200，0. 4000，0. 4800 g 和辅料适量，加人凝血因子VIII原液7. 5 mL，肝素钠适量，用1. 0 mol·L － 1 盐酸调pH 至6. 9，加0. 01 mol·L － 1枸橼酸三钠溶液溶解并定容于20 mL。分别制备成16. 0， 20. 0， 24. 0 mg·mL － 1溶液。
3. 3. 2 空白溶液按公司处方，加入辅料的混合物，用注射用水制备各空白溶液
3. 4 内标溶液精密称取α －氨基丁酸( AABA)0. 4 g，加注射用水定容至100 mL。
4 氨基酸衍生方法
4. 1 精密量取供试品储备液、样品及对照品储备液各1. 0 mL，加1. 5%磺基水杨酸9. 0 mL，混匀静置2 h以上， 3000 r·min － 1离心10 min，留取上清液。
4. 2 精密量取“4. 1”项下上清液1. 0 mL( 其中对照品储备液对应上清液分别精密量取0. 06， 0. 4，0. 8，1. 0， 1. 2， 1. 6 mL) ，分别置10 mL 量瓶中，用注射用水定容。制备成供试品溶液、样品溶液及浓度分别为1. 5， 10. 0， 20. 0， 25. 0， 30. 0，40. 0 mg·mL － 1 的对照品溶液。
4. 3 精密量取“4. 2”项下溶液各100 μL，分别加注射用水0. 4 mL 及内标溶液20 μL，混匀备用。
4. 4 精密量取“4. 3”项下溶液30 μL 放入衍生管中，加硼酸缓冲液( pH 8 ～ 10) 210 μL 涡旋混合，并加入AQC 衍生剂60 μL 涡旋混合15 s，即为各供试品溶液，待用。

精
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分
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青林

第1楼2015/09/26

针对上次的结果，为了使组氨酸与甘氨酸有效分开，本人对梯度洗脱的程序进行修改
1、为了使10min--19min之间有足够多的峰，应将之间的时间变长。

2、利用洗脱的线速度来说，3.9*150mm的色谱柱及10ul的体积，走完色谱柱需要5,min。故减少6%乙腈时间应该在5-6min左右。从7min开始试验，看组氨酸与甘氨酸是否有分离的迹象。
序列表1

图谱1,甘氨酸与组氨酸有部分分离。

结果证明，组氨酸与甘氨酸果然有分离

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青林

第2楼2015/09/26

继续减少6%的乙晴的梯度洗脱时间

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青林

第3楼2015/09/26

继续减少

甘氨酸与组氨酸分的越来越开了

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青林

第4楼2015/09/26

过了，不行了

达到４ｍｉｎ时，组氨酸的峰洗脱加快，且峰的数目也不对，估计被包在６ｍｉｎ的大峰里面

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青林

第5楼2015/09/26

继续优化

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青林

第6楼2015/09/26

好了，这是最好的结果了，

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青林

第7楼2015/09/26

最终图谱，组氨酸与甘氨酸分离度大于1.5，1.669，差强人意。

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青林

第8楼2015/09/26

５。结果与讨论
５１　按新的试验方法，进行准确度和重复性试验，准确度在95.0%-105.0%之间，9次数据的RSD小于2.0%
5.2 通过线速度理论可以减少试验的摸索时间，梯度的适当调整可以有效改善试验结果
5.3 由于最佳试验的分离度未1.669，虽然符合”大于1.5“的要求，但不保险，还应从色谱柱、流动相（自配和买的可能有所区别）等因素再考虑。但由于时间太少，要搁置很久了。

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青林

第9楼2015/09/26

希望大家给我建议，谢谢大家的支持

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荆棘鸟fiona

第10楼2015/09/27

建议最好汇总到一楼哦~~，不然会扣分哒http://bbs.instrument.com.cn/topic/5958088
青林(wyqql2060) 发表:希望大家给我建议，谢谢大家的支持

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