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酸甜苦辣，品味生活——0502

一片枫叶

2016/05/13

液相色谱（LC）

曾经有人这样说：生活就像一团麻，总有解不开的小疙瘩；还有人这么说：生活就是醋和酒，饱含着人生酸辣苦；也有人比喻说：生活就是七彩霞，有时也把苦雨洒；甚至有人说：生活就像一首歌，吟唱着人生苦和乐。
哈哈…这话真的还不假，深刻领会细琢磨，工作乏味也有乐。
实验员瓶瓶罐罐，分析员故障频繁，群友工作遇到困难，微群交流征求答案，气氛和谐令人点赞，分享经验引以为鉴。
问题一：岛津液相色谱SPD-20A更换新氘灯后流通池和参比池能量均只有200左右，请问是光路系统需更换么？
答：样品池能量反映输液系统流通池是否污染，参比池能量反映灯能量和光路系统是否完好。新灯，甲醇流动相，220nm波长，参比能量低于400，就是光路问题。

问：我们隔一段时间就要检查一下样品池么？
答：在其它都正常的情况下，峰响应降低，基线噪音增大漂移，就要检查样品池和参比池了。
问：是不是也相当于冲洗样品池了？
答：柱子的污染物会污染流通池，单独的清洗柱子不要接检测器，根据判断情况，分别清洗，清洗柱子，不接检测器。清洗流通池，不接柱子。
问题二：紫外检测器，柱子新的C18，已经平衡过，物质是混合标样，它们结构类似用甲醇溶解，流动相乙腈梯度从60%的水相走到30%，时间40min，两个峰现在要分开，该调整哪方面因素呢？

答：如果的是刚开始做的话可能就是流动相的问题，可以适当改变一下流动相的比例，使用流动相配置标品。如果前期正常的话考虑换下柱子，重配流动相，控制好室温就差不多了。
互溶只是保证样品不析出，溶剂强度影响还在，举个例子：纯乙腈溶解的样品，进入到乙腈水流动相，溶剂乙腈首先有一个向乙腈水的扩散，捎带把样品也带着扩散了，峰型等都会受影响，出峰早的话，甚至会一个峰分裂成俩，如果溶剂和流动相一样，就不存在这个过程。
问题三：大家实验室有机系和水系滤膜材质，一般都是什么，其中想了解下，聚四氟乙烯膜(PTFE）好用不，滤有机系，其吸附能力对样品有多大？
答：现在我们实验室用的最多的就是PTFE滤膜，过有机相，水相都没问题，对样品的吸附能力一般要看样品来定，而且它耐酸耐碱，还是比较好用的。
问：PTFE滤膜过水系是如何操作。不是说疏水系材质吗？
答：分亲水和疏水两种，亲水的比较好用，可以过水相。
问题四：请问这个东西可以清洗吗？

答：主动阀，拆开里面有一个小滤芯，可以超声清洗，或者更换新的。
问题五：为什么碱性化合物，低ph更有利于得到对称峰？
答：不建议流动相太酸或太碱拖尾可接受就好，碱性物质有些拖尾是可以接受的，使用二次封尾的色谱柱——硅羟基的两次键合，防止裸露硅羟基吸附样品而拖尾。
碱性化合物低PH值下离子化了，所以固定相对其保留能力减弱了，峰型就不拖尾，但是保留时间一般都很短的，优缺点很明显，有些方法可以利用这一点。
加离子对试剂也能改善峰形。

问题六：做对甲苯磺酸C18色谱柱，流动相是水（0.1%磷酸）:乙腈，出现肩峰怎么解决？
答：试试0.2乙酸加0.01mol乙酸铵，主要是抑制物质电离，避免物质和硅醇反应，或者使用离子色谱柱——硅胶表面键合带电荷基团的色谱柱。
带磺酸根的有机物也不能用很低的酸做流动相，否则要么不出峰要么没有峰形。磺酸酸性很大，如果流动相Ph值很低的话，则其在色谱柱上的保留极大，不被流动相洗脱，而用离子对的话，其保留行为就会发生改变。
问：对甲基苯磺酸极性很大，出峰很靠前的，推荐个流动相。
答：0.1%磷酸水比乙腈1:1，之前测过酸酐，这个是副产物。随样品放置时间变，这个东西肯定要用酸性条件。
问：0.1磷酸水:乙腈=20:80，然后用的0.01M乙酸铵水：乙腈结果都不理想，打算用离子对试剂。以前低浓度的对甲苯磺酸倒是可以，峰也很尖，但是现在怎么都不行了,这是用磷酸水的图谱。

问：你用什么溶解样品的？
答：乙腈
结论：用流动相就好了，这个是溶剂原因产生的。
问题七：不泵液了，怀疑单向阀的问题，这上面那个是单向阀吗？

答：在泵的后面有一个单向阀，单向阀里面有个粉红很小的红宝石球，可以用手电照一下看看是不是。
安捷伦1260主动阀，一个泵不泵液，一年没有用，现在确认单向阀之前管路是通的，机器两个泵，另外一个泵正常，现在超声单向阀。

结论：通过单向阀超声，问题解决了，应该是泵长期不用，单向阀阀球与阀座粘连，致使不能泵液。不过超声单向阀应该出口向上不应躺着哦！
问题八：倒峰求解——安捷伦1200HPLC，正相色谱分析。

答：把溶剂换成流动相吧，如果这两个都不是你要的，那无所谓，如果有你要的，可能要重选波长。可能是溶剂或者样品里面的成分在这个波长下吸收为负了。
在色谱分析中，好多色谱工作者通常会遇到伪峰的情况，这种现象给正常色谱分析工作带来了极大的干扰和影响。为解决这个问题，首先必须弄清楚产生伪峰的原因。
　　最简单的情形是所用的流动相在检测波长下有吸收，而进在此波长下没有吸收的溶剂，在流动相中会出现"洞穴"，通过色谱柱后出倒峰。
　　至于伪峰产生的原因，可作如下解释：
　　通常样品（X）和流动相（M）间可能存在两种作用--协同的吸着作用和竞争的吸着作用。
　　假设样品分子X不可检测（无紫外吸收），流动相组分M可检测。M常是流动相中的杂质，而X可能是溶解样品溶剂中的杂质或组分，或者是真实的样品组分。在协同吸着作用下，如果tM小于tX，流动相组分首先离开柱，则M以倒峰先离开柱，接着X出正峰；如果M和X的保留时间相反，即tM大于tX，则X先离开柱出倒峰，后流出的M出正峰。
　　在离子对色谱中是以协同吸着作用为模式。在反相或正相色谱中是竞争而不是协同，结果引起不同形式的伪峰：先出的伪峰是正峰，后出的伪峰是倒峰。
　　一旦出现了伪峰，可考虑用下面几种思路予以纠正：
　　（1）用纯试剂作流动相。以高质量的离子对试剂和缓冲物质配制流动相，各类试剂加和起来应产生最小的伪峰效应。
　　（2）用流动相溶解样品。以其它溶剂溶解样品可能产生伪峰或导致伪峰的产生，用流动相溶解样品可减少产生伪峰的几率。
　　（3）进最小体积的样品溶液。伪峰常与样品体积成比例，离子对色谱的进样体积要低于50微升。
　　（4）预处理好样品。样品中的杂质会促成伪峰的出现。
　　若用上述方法还不能去掉伪峰，则可视作为特殊的干扰峰来处理，即作为特殊的组分。改变色谱条件，使伪峰位置发生变化，避开被干扰的峰。
问题九：有个问题请教一下各位大神，现在我在跑一个标，重复进六针，但是S/N的误差很大，最少1700，最多2700，手动进样的，第一针到第六针有高有低，没有递增或递减的趋势，造成这种现象是什么原因呢？
答：1：信噪比的截取时间不要包括前面杂质峰，选取不带峰的基线，最小标峰设小点自动积分。
2：LOQ一般情况是检测浓度的0.02％以下，如果定量限已经小于0.02％，那检测限不必吹毛求疵，检测限不是定量限稀释3倍就可以了。

问题十：一个样品，我怎么确定它的流动相中是加四丁基溴化铵，还是加磷酸二氢钾呢？它们在流动相中分别起到什么作用？
答：1、作用原理
加入离子对试剂后，它可以与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。
离子对分为正离子对和负离子对，分析酸性样品（确切的说应该是作用基团）用正离子对试剂，分析碱性样品用负离子对试剂。
正离子对试剂可以吸附带负电荷的样品组分，负离子对试剂反之。戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠……十二烷基磺酸钠都属于负离子对试剂；四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵一类属于正离子对试剂。
离子对要考虑样品体系的复杂性和干扰物的特性，先用原则一般尽可能使用碳链短的先，这样可以避免强保留造成对柱子效能的影响，同时，浓度尽可能的低，以保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。”
看来做实验下手轻点儿好，从碳链短的开始，从低浓度开始，不行再慢慢加。不过这次的使用经验是从碳链长度中等的开始，可以更快看到效果，节约摸索分析条件的时间。同时流动相PH值尽可能低以确保离子化程度。
2、试剂的使用
离子对试剂不一定是表面活性剂，如己烷和庚烷磺酸钠，又如三乙胺或四丁基溴化胺，不具表面活性作用。所以用己烷和庚烷盐就没有泡末，用四丁基溴化胺也不产生气泡。十二烷基磺酸钠（或硫酸钠），或者十六烷基溴化钠（CTAB,一种做阴离子用的阳性表面活性剂），在浓度高的时候容易产上泡末。做HPLC时流动相里加的SDS或CTAB浓度一般不会太高，一般在0.1%以下，而且流动相里有甲醇等有机溶剂，高浓度的有机溶剂有破乳的作用，因此，混合后的流动相泡末应该不会很多。另外，做电泳加入的SDS量很大的比如做蛋白质SDS胶，或者毛细管电泳里的MECC，SDS浓度很高，而且没有或者有很少比例的有机改性剂，当然会有气泡，跟HPLC不完全相同。有点泡沫不要怕，确保溶液摇匀就好。
使用离子对试剂时，调节保留时间的方式与普通反相不同，变化有机相比例没有改变PH值来得有效。
当流动相PH值较高时，样品以中性形式存在，那么正电荷较少，相应的保留较弱；当流动相PH值较低时，样品便以质子碱H+形式的离子状态存在，那么正电荷与固定相上带负电荷的-SO3强烈吸附，相应的保留会非常强。
再说明一下B物质的pKa，其值为10.5，在pH为4.5、3.8时都以离子态存在，这点没错，虽然都是离子态，都是99%以上，但从量上说还是有点不一样的。任何物质以离子态存在时都有一个平衡的状态：B＋（H＋）＝＝（BH＋），这里存在着一个平衡常数K（或者说离解常数），于是pH不同时，H＋不同，对应的B、BH＋也不同。所以才会出现pH不同，保留值会不同。
另外我认为4.5和3.8的pH相差不大，其改变对物质的保留值影响不会很大，因为在流动相中还受到很多因素的影响。
3、使用后清洗
大家都强调离子对试剂要冲洗较长时间才能洗去。想想也知道那简直是一定的，使用前平衡了老半天呢，要是轻易就能洗去就怪了。
对于多数离子对试剂，清洗还是比较简单的，平时的水——甲醇就能奏效，只是时间必须长点，2小时比较好。
有些例子比较特殊：
如果用TBA的话应该需要好好洗洗柱子，因为这种胺类的东西不容易洗干净，且会慢慢溶解硅胶。通常TBA是用0.1%的磷酸，（其中含有100mM 高氯酸钠）与甲醇 1：1 来洗。磷酸的作用是调节pH, 高氯酸钠可以把胺带下来，甲醇增加对有机物的溶解度。
根据试验经验，SDS在酸中的溶解性较差，因为它是强碱弱酸盐，在酸性条件下可以生成不溶于水的弱酸十二烷基磺酸，但此酸在有机相中溶解性较好，所以即使在水相中有不溶解的SDS，在加入有机相后反而会使之溶解。所以在流动相中不含有其他盐时，完全可以用比例较高的有机相水洗涤。
4、其他
很早就知道，醋酸铵可以起部分离子对试剂的作用，没想到TFA也可以。
英文文献中是经常称之为ion-pair reagent的！而且不只是用来掩蔽填料上残留的活性硅羟基，TFA的氟端还能与分析物的疏水部分相“配对”呢。
缓冲液可以更准确的控制所需的PH值，而加酸所得到的PH值不够稳定，很容易随着温度、流动相组成的微小变化而改变，但是缓冲液中的盐成分对色谱柱的使用寿命来讲不是什么好事。
选用酸还是缓冲液来控制流动相PH值，最好依据分析方法的耐用性来选择！保留性、选择性对PH的变化不是很敏感的话，加酸应该就可以了！
另外：磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液可以控制的PH值范围是不同的！
磷酸盐可以控制PH值范围在2.1～3.1和6.2～8.2
醋酸盐可以控制的PH缓冲范围是3.8～5.8”

相关话题

zhy8113855

第1楼2016/05/13

谢谢楼主分享

0

light2357302

第2楼2016/05/13

不错，问题都挺典型的

1

feigekai

第3楼2016/05/13

枫叶，辛苦了。

0

又又1990

第4楼2016/05/13

枫神辛苦了哈哈

0

p25492417

第5楼2016/05/13

谢谢分享!

0

PAEs

第6楼2016/05/16

应助达人

疯神，太牛掰啦！

0

小牛nht

第7楼2016/05/16

有利于增加经验，谢谢分享，，

0

一片枫叶

第8楼2016/05/16

应助达人

感谢各位坛友的支持和鼓励！

0

拉菲

第9楼2017/10/17

好
light2357302(light2357302)发表:不错，问题都挺典型的

0

flyaway

第10楼2017/10/17

楼主还在更新吗？

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