SEC色谱柱柱效检查所用试剂如何选择

应助达人

说明书中也是用BSA做住效检测的吗？不同物质测出来的柱效可能会产生差异，您可以在初次使用时测一下柱效，然后下次用同样的物质，同样的色谱方法进行柱效测定比较

说明书中用了五种物质量（甲状腺球蛋白、γ-球蛋白、卵清蛋白、核糖核酸酶A、对氨基苯甲酸），但最后以对氨基苯甲酸来计算的塔板数。我们是每做一次检验都要进行柱效检查的，基于当初方法开发时用的BSA做柱效，所以一直都用它来做。现在我们想换一种更纯点的物质来做，但不知道在选择柱效检查的试剂时有没有要遵循一定的原则？希望能给予指点。谢谢呀！

应助达人

用常做的物质来作为柱效检测标物我觉得还是比较好的，前面有个小峰更好，还可以考察灵敏度与分离度。标准上的柱效测定物的选择原则是易得、稳定、响应因子适当、好测，并不是以应用为目的，只是提供参考。比如C18柱测一些复杂样品测不好，但以萘来检测柱效还是很高。

应助达人

一般按照说明书的试剂

以前面的小峰来考察灵敏度和分离度，那仅仅关注柱效是不是不太合理（我们目前整个实验考虑的点有：1、空白，基线是否平衡；2、柱效，是否不小于8500；3、系统适应性的保留时间和峰面积CV）？我们现在的状况是前面会出现几个小峰，都不太能分开，而且最开始出现的那个峰一般是只要做都会有，峰面积大概500+，但是最近观察到有时候开始是没有或峰很小（峰面积几十），但多走几针后峰面积会逐渐增大，这是不是说最初的没有或峰面积很小，是柱子的灵敏度还没到最佳状态，所以开始分辨不出来？但我说的这些情况，都是在满足柱效要求（不小于8500）的基础上出现的。有些困惑，希望能解答，辛苦了！另外如果要以前面的小峰考察灵敏度和分离度，怎么操作了，问题也许有些小白，请耐着性子还是给予一些指点，谢谢了！

用说明书里的试剂，那流动相是不是也应该用说明书里的？但受限于QC、GMP（我们是QC实验室），在这个检验项目里，需要同时完成柱效和样品的检验，用到的流动相只能根据样品来定，不知道选说明书里的试剂，却不用其对应的流动相适不适用？

学习了

看说明书或者问工程师

如果计算柱效应该是用：对氨基苯甲酸。
如果要看分离度，以及各区段蛋白的对称性，就要用多个蛋白的混合物，最好用说明书～检测报告中的样品～混合物，包括蛋白和对氨基苯甲酸。
如果用白蛋白测定柱效，除非你测定的蛋白也是白蛋白，否则就没有必要了。无论是看柱效，还是分离度，或者对称性，乃至重复性。因为对你的检测指导意义不大。
最好用说明书的方法，或者用你的检测物质去计算，无论是柱效，还是其它指标。
白蛋白的凝胶纯度，正常应该是有多个分子量的，不仅有二聚体，还有三聚体，以及多聚体，只要上样量足够了，你就能看到。