气相色谱-串联质谱技术检测水中己烯雌酚残留量
摘要：本实验建立水中己烯雌酚残留量的气相色谱-串联质谱联用（gc-MS/MS）分析方法。样品采用乙酸乙酯提取，浓缩后甲醇溶解，经氮气吹干后加入BSTFA/TMCS衍生化试剂70℃衍生30mins，氮气吹干后甲醇定容待测，采用gc-MS/MS分析时，己烯雌酚衍生物在15 mins内流出。对采集的水样进行两种浓度的加标质控，回收率均在90%以上，相对标准偏差（RSD）在3.0%以内。在0.05~1.00 mg/L的浓度范围内呈线性关系，相关系数大于0.999。检出限为1.20 μg/L。该方法可准确用于环境水样中己烯雌酚残留的定量分析，灵敏度、精密度和准确度均满足残留检测的分析要求。
关键词： 己烯雌酚；气相色谱-串联质谱；残留量；水
中图分类号： 文献标识码： 文章编号：
Determination of Diethylstilbestrol residues in water sample by gas chromatography-tandem mass spectrometry
ABSTRACT: To establish a method determination of diethylstilbestrol (DES) in water sample by gas chromatography-tandem mass spectrometry (gc-MS/MS). The samples were extracted by ethyl acetate, derived with silanization reagent at 70℃ for 30 mins, then the extracts were determined with MS/MS detector based on SCAN and MRM mode, DES was well separated within 15 min. When the spiked average recoveries above 85%. The RSD ranged within 3.0%, The calibration of those pesticides were linear (correlation coefficients not less than 0.999) within the range of 0.05~1.00 μg/mL. The method was accurate and sensitive, was suitable for analysis of DES residues in water samples.
KEY WORDS: diethylstilbestrol; gas chromatography-tandem mass spectrometry; residues; water sample
1 引言
己烯雌酚(Diethylstilbestrol, DES)属激素类化合物，作为生长促进剂被广泛添加在饲料中应用于水产养殖行业促进鱼类生长，为水产业产品数量的增长发挥了一定作用。但己烯雌酚作为一种人工合成的具有雌激素样作用的化学物质，许多科学实验证实对人类和动物具有危害，导致机体代谢紊乱、发育异常或肿瘤等，是一种致癌物质，被欧盟等国在食用性动物饲养中列为禁用品[1]，2002 年我国农业部发布176号公告禁止在畜禽水产养殖过程中使用己烯雌酚[2]。
己烯雌酚是脂溶性物质，难降解，易在动物体内残留，在水源和土壤中容易大量富积，造成环境激素污染恶性循环，由于会对环境水造成严重影响, 可通过饮用水威害人体健康 。因此，建立水样中己烯雌酚残留量的分析方法具有重要意义。目前，测定雌酚类激素的方法有酶联免疫(ELISA)法、比色法、电化学法、放射免疫(RIA) 法、色谱-质谱法、高效液相色谱(HPLC)法及毛细管电色谱法等。比色法、电化学法由于不能用于分离且干扰大等缺点，很少用于残留检测。本实验采用灵敏度和准确度较高的串联质谱检测器，可提高己烯雌酚定性与定量的准确性，二级质谱相对于一级质谱，其抗干扰能力更强，可有效消除单级质谱离子信息少的问题，对样品前处理的要求较低，可准确反映样品中己烯雌酚的残留量，其灵敏度、稳定性、准确度均较高。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验原材料
无公害水产养殖基地：淡水养殖用水。
2.1.2 主要试剂与材料
乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；乙醚、叔丁基甲醚（优级纯，天津化学试剂厂）；己烯雌酚标准品(德国Dr. Ehrenstorfor公司)；衍生化试剂：N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三甲基碘硅烷(TMIS)、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺/三甲基氯硅烷(BSTFA/TMCS体积比99:1)(美国Supelco公司)。
2.1.3 主要仪器
气相色谱-串联质谱仪（7890B-7000B，美国Agilent公司）；离心机（CT18RT，上海天美公司）；氮吹仪（MG-2000，日本EYELA公司）；旋转蒸发仪（SB-1100，日本EYELA公司）。
2.2 标准溶液和衍生化试剂配制
己烯雌酚标准溶液：配制10.0 mg/L的标准储备液，保存于1~4 ℃冰箱中冷藏，使用时用甲醇稀释至相应浓度做标准工作曲线。
MSTFA-DTE-TMIS衍生化溶液：准确称取0.0040g DET溶解到2.00mL MSTFA，加入5.00μL TMIS，低温于1~4 ℃冰箱中冷藏避光保存。
2.3 样品前处理
2.3.1 分离提取
准确量取40.0 mL水样品于具塞离心管中，加入20 mL提取试剂乙酸乙酯，振荡后放入高速离心机10000 r/min离心3 min，将上层有机相倒入浓缩瓶中，40℃减压浓缩近干，用甲醇溶液5 mL定容，转移至10 mL试管中氮气吹干。
2.3.2 衍生化
在吹干的试管中加入0.20 mL的衍生化试剂，在70℃烘箱中衍生化30 min，取出后氮气吹干1.00 mL甲醇定容上机。
2.3.3 标准曲线及质控样
分别配置0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L浓度的标准工作液，按2.3.2衍生化后进样制作标准曲线，同时将样品添加不同浓度的标准品按2.3.1和2.3.1试验过程进行回收率质控试验。
2.4 仪器条件
色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm, 0.50 μm）；载气：氦气（99.999%）；恒流模式流速：1.00 mL/min；进样：1.00 μL，不分流；进样口温度：250 ℃；程序升温：80 ℃保持1 min，以20 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度270 ℃；溶剂延迟：3 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。扫描范围：50～450 amu；定量方式：外标法。
3 结果与讨论
3.1 提取溶剂选择
本实验选择了乙醚、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷等溶剂作为提取剂，通过对添加浓度为1.00 mg/L的样品分别进行萃取回收率测定，由图1可见乙酸乙酯的萃取效率最高，萃取回收率稳定并达到90%以上， 所以本方法选择乙酸乙酯作为提取溶剂。
图1
不同溶剂提取效率
Fig. 1 Effect of Different Solvents on Extraction Efficiency
3.2 衍生化试剂及衍生化温度的选择
本次试验选择MSTFA-DTE-TMIS和BSTFA/TMCS(99:1)两种衍生化试剂，均能与己烯雌酚的羟基进行硅烷化衍生反应，确定衍生化时间为30min，考察不同温度对于衍生化效率的影响，结果见图2。由图2可见，在70℃条件下衍生化效率最好，不同温度条件下衍生化试剂BSTFA/TMCS (99:1)的效率均优于MSTFA-DTE-TMIS，同时BSTFA/TMCS(99:1)有配制好的商品可供购买，使用便捷，且毒性也较小，因此本次试验选用BSTFA/TMCS为最佳衍生化试剂。
图2 不同衍生化温度对两种衍生化试剂的衍生化效率影响
Fig.2 Relative response factors of different derivatization temperature for two derivatization reagents
3.3 气相色谱-串联质谱方法优化和选择
对己烯雌酚标准品衍生物进行质谱分析，采用全离子扫描（质量数50~450u范围内）确定目标化合物的保留时间和一级质谱图，由图3可选择己烯雌酚衍生物的碎片离子以m/z为412为母离子，在优化的色谱和质谱条件下进行子离子及碰撞电压的优化试验，通过图4可确定子离子和最佳碰撞电压。
图3 己烯雌酚衍生物一级质谱图
Fig. 3 The primary mass spectra of diethylstilbestrol derivatives in EI mode
图4 优化子离子及碰撞电压色谱图
Fig. 4 Optimization of the daughter ions and collision voltage chromatogram
3.4 方法的线性范围
通过气相色谱-串联质谱联用仪分析己烯雌酚标准品的色谱图见图5，以峰面积对应其浓度做标准曲线，方法学参数见表1，图6为己烯雌酚标准品的标准曲线。
图5 不同浓度己烯雌酚衍生物的gc-MS/MS色谱图（0.05~1.00 mg/L）
Fig. 5 The chromatogram of diethylstilbestrol derivatives by gc-MS/MS(0.05~1.00 mg/L)
表 1 己烯雌酚衍生物的串联质谱检测条件及方法学参数(n=5)
Table 1 Testing conditions and methodological parameters for MS/MS analysis of
diethylstilbestrol derivatives (n=5)
组分 | 保留时间 （min） | 定量离子对（m/z） (碰撞能量/eV) | 定性离子对（m/z） (碰撞能量/eV) | 线性方程 | 相关系数r2 | RSD% |
己烯雌酚 | 11.40 | 412>383(20) | 412>217(20) | Y=12979X-422.88 | 0.9986 | 2.58 |
图6 己烯雌酚衍生物标准曲线（0.05~1.00 mg/L)
Fig. 6 Standard curve of diethylstilbestrol derivatives (0.05~1.00 mg/L)
3.5 方法回收率、精密度及检出限
对待测样品添加0.05和0.20 mg/kg两种不同浓度的标准，按上述试验步骤操作，每个添加浓度各5个平行样品，进行回收率的重复测定。对空白样品基质进行20次测定，按照3倍信噪比（S/N）作为定量检出限，通过计算所得己烯雌酚检出限为1.20 μg/L。样品加标回收率、相对标准偏差(RSD)见表2。
3.6 样品的测定
为验证该方法的可靠性和准确性，本次试验选择新疆地区五个大型无公害水产养殖基地共20个淡水养殖用水样品进行检测，在检测的样品中均未检出己烯雌酚药物残留。
表2 己烯雌酚衍生物的平均回收率、RSD值及检出限(n=5)
Table 2 Recoveries, relative standard deviation and detection limit of diethylstilbestrol derivatives (n=5)
样品名称 | 添加水平 （mg/kg） | 测定结果（mg/kg） | 回收率（%） | 平均回收率（%） | RSD（%） |
淡水养殖用水 | 0.05 0.20 | ND | 90.1、92.5、88.6、93.2、89.4 93.6、91.4、94.1、90.8、89.6 | 90.8 91.9 | 2.20 2.07 |
4 结论
本实验建立水中己烯雌酚残留量的方法，采用乙酸乙酯提取水中残留的己烯雌酚，BSTFA/TMCS衍生化试剂进行衍生化试验，通过气相色谱串联质谱仪器进行定性、定量分析。通过不同浓度的标准工作液进行测定，得到线性回归方程相关系数大于0.999以上，表明己烯雌酚衍生物在该浓度范围内呈现良好的线性关系，可满足渔药残留检出的定量要求，在对样品添加的不同浓度水平的己烯雌酚标准品进行质控试验，己烯雌酚标准品衍生物的回收率大于90%以上，相对标准偏差小于2.5%，通过计算得到定量检出限(LOD)为1.20μg/L，以上指标均符合药物残留试验及相关标准法规的分析要求。因此该方法的前处理步骤简便、快速，测定的准确度和精密度较高，适用于水中己烯雌酚类药物残留的检测工作。
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