如何做好ELISA（一）——设备耗材篇

我是风儿

2016/08/21

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食品毒素/微生物检测

如何做好ELISA（一）——设备耗材篇
酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一项经典的分析方法，最早可追溯到19世纪末诞生的免疫凝集试验。1896年，Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌病人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验（Widal test）。但是，以免疫沉淀和免疫凝集反应为基础的免疫检验技术的局限性还是非常明显的，如测定灵敏度低，除少数外，基本上都是定性测定等，这些缺陷大大限制了其在病原体感染诊断及体液中微量生物活性物质测定中的应用价值。60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等发展了一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA），这种简单方便的免疫测定技术出现后，成为了一种稳定，可靠的快速定量分析方法，目前已原来越多的用于食品检测中，用于测定毒素、兽药、农药、非法添加物、过敏原、转基因等等。但是，作为一种生化分析方法，仪器、试剂是其重要的硬件条件，对结果有着显著的影响，必须严格核查和验收：

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第1楼2016/08/21

应助达人

一、仪器核查
　　为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、恒温箱、洗板机和酶标仪。
　　1、移液器：ELISA加样量小（20-200μL），其准确性直接影响实验结果，因此必须定期计量。计量周期内可利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在?5%以内；
　　2、恒温箱：必须定期计量其37℃温度点。并经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有?1℃的误差；
　　3、洗板机：洗板机虽然不是ELISA的核心仪器，但是其性能往往决定了ELISA的准确性。每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μL；洗涤后人工拍板时，垫纸不湿；洗液如含有吐温应随用随配并定期检查管孔是否堵塞；
　　4、酶标仪：分为滤光片式和连续波长式。滤光片式酶标仪价格便宜，对特定波长的吸光度值测定较为准确，应该经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。连续波长式酶标仪价格较为昂贵，一般可以测定紫外-可见光范围内的任意吸光度值，但在固定波长的测定稳定性上不如滤光片式酶标仪。

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第2楼2016/08/21

应助达人

二、试剂盒质控
　　应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂盒的质控可参照SN/T2775-2011《商品化食品检测试剂盒评价方法进行》，从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性全面评价。
　　1、灵敏度和检出限：灵敏度为试剂检出被检物质的最低量的能力；检出限为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
　　2、特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
　　3、精密度：ELISA试剂一般指其批内变异系数，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
　　4、准确度：通过添加回收实验进行评价。
　　5、简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。