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高效液相色谱法测定可乐中苯甲酸、糖精钠、安赛蜜和咖啡因的含量

会师楼

2016/10/25

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厂商论坛

1 引言
根据我国食品卫生法(1995年)的规定，食品添加剂是为改善食品色、香、味等品质，以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质。苯甲酸可以用作食品、饲料、乳胶、牙膏的防腐剂。在酸性条件下，对霉菌、酵母和细菌均有抑制作用，但对产酸菌作用较弱。苯甲酸分子态的抑菌活性较离子态高，故PH小于4时，抑菌活性高，抑菌的最适pH值为2.5～4.0，一般以低于pH值4.5～5.0为宜。由于苯甲酸对水的溶解度低，故实际多是加适量的碳酸钠或碳酸氢钠，用90℃以上热水溶解，使其转化成苯甲酸钠钠后才添加到食品中。若必须使用苯甲酸，可先用适量乙醇溶解后再应用。由于苯甲酸对水的溶解度比苯甲酸钠低，因此在酸性食品中使用苯甲酸钠时，要注意防止由于苯甲酸钠转变成苯甲酸而造成沉淀和降低其使用效果。苯甲酸在酱油、清凉饮料中可与对-羟基苯甲酸酯类一起使用而增效。糖精，曾是一种饱受争议的甜味剂。研究人员曾对它做过一些动物实验，实验结果表明该物质具有致癌作用，因此FDA于1977年明令禁用该物质。但因餐饮行业（以及节食者）的坚持，糖精至今仍在市场上出售。但到了20世纪90年代末，包含糖精的产品包装上均贴有警告标签，指出糖精对实验室动物具有致癌作用。而美国热量控制委员会指出，人们不会像老鼠一样患上膀胱癌，因此，应该除去这个警告标签。在2000年，美国国会废除了相关法规，糖精产品不必进行健康警告标签。安赛蜜是一种食品添加剂，是化学品，类似于糖精，易溶于水，增加食品甜味的，没有营养，口感好，无热量，具有在人体内不代谢、不吸收（是中老年人、肥胖病人、糖尿病患者理想的甜味剂），对热和酸稳定性好等特点，是当前世界上第四代合成甜味剂。它和其它甜味剂混合使用能产生很强的协同效应，一般浓度下可增加甜度30%~50%。安赛蜜具有强烈甜味，甜度约为蔗糖的130倍，呈味性质与糖精相似。高浓度时有苦味。安赛蜜为人工合成甜味剂，经常食用合成甜味剂超标的食品会对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对老人、孕妇、小孩危害更为严重。如果短时间内大量食用，会引起血小板减少导致急性大出血。咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时的驱走睡意并恢复精力，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。有咖啡因成分的咖啡、茶、软饮料及能量饮料十分畅销，因此，咖啡因也是世界上最普遍被使用的精神药品。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 材料与试剂
空白可乐样品: 可口可乐原味(无咖啡因)(美国可口可乐公司); 样品: 可口可乐。苯甲酸钠; 糖精钠; 安赛蜜; 咖啡因;甲醇; 乙酸铵。
2.1.2 仪器与设备
Agilent 1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);天平; 离心机。
2.2 实验方法
2.2.1 标准品
(1)标准储备液的配制
精密称取苯甲酸钠、糖精钠、安赛蜜和咖啡因标准物质60、65、50、50 mg(精确至0.1 mg),分别置于50 mL 容量瓶中, 用水溶解并稀释至刻度,摇匀, 得到相应标准储备液, 4℃冰箱保存。
(2)混合标准中间溶液的配制
精密量取苯甲酸钠、糖精钠、安赛蜜和咖啡因标准储备液2.0 mL, 置同一10 mL 容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 得到混合标准中间溶液, 临用新制。
(3)混合标准工作溶液的配制
精密量取标准中间溶液适量, 置于10 mL 容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 配制成系列线性标准工作溶液, 供高效液相色谱仪测定。
2.2.2 样品处理
样品经超声脱气后, 精密量取1 mL 至2 mL 容量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 经0.45 μm 滤膜过滤, 滤液供高效液相色谱仪测定。
2.2.3 液相色谱条件
色谱柱为月旭色谱柱，Ultimate XB-C18 4.6 x250,5um(part Number 00201-31043 Serial Number 211302350 Lot Number 2101.77)
流动相A: 乙酸铵缓冲液(0.02mol/L), 流动相B: 甲醇, 梯度洗脱程序: 0~0.5 min, 流动相B 5%;0.5~6.0 min,5%~10%; 6.0~9.0 min, 10%~20%, 20%维持2min;11.0~16.0 min, 20%~75%, 75% 维持3min,19.0~20.0 min, 75%~5%, 5%维持7 min。流速1.0mL/min;进样量为20 μL; 柱温30 ℃; 检测波长230 nm 和272 nm。
3 结果与分析
3.1 方法的线性范围和检出限
将 2.2.1(3)系列线性标准工作溶液(浓度范围为2.0~200 μg/mL)在2.2.3 仪器条件下进行分析, 建立标准曲线, 苯甲酸、糖精钠、安赛蜜和咖啡因的相关系数r 均大于0.999。以逐渐降低样品中标准溶液添加量的方法进行实验, 以峰面积相当于基线噪音的3倍(S/N=3)计算检出限。苯甲酸钠、糖精钠、安赛蜜和咖啡因的保留时间、检测波长、检测限等见表1。
表1 检测波长、检出限、相关系数

化合物	检测波长 (nm)	线性范围 (μg/mL)	相关系数	检出限 (μg/mL)
苯甲酸	230	2.0~200	0.9999	0.01
糖精	230	2.0~200	0.9999	0.02
安赛蜜	230	2.0~200	0.9999	0.01
咖啡因	272	2.0~200	0.9999	0.005

3.2 回收率和精密度
在空白可乐中添加 3 种不同浓度的标准溶液,按2.2.2 项下进行前处理后, 按2.2.3 项下色谱条件进行测定, 每个加标水平平行测定6 次, 结果见表2。本方法在3 种不同浓度水平的回收率为97.1%~103.0%,RSD为0.5%~2.8%, 回收率高, 重现性好。
表2 空白加标回收率和精密度(n=6)

化合物	加标量(μg/mL)	加标量(μg/mL) 回收率(%)	RSD (%)
苯甲酸	5.0	98.3~102.1	2.1
	10.0	97.5~102.5	1.8
	50.0	99.5~101.2	0.5
糖精钠	5.0	97.5~102.9	2.8
	10.0	98.5~102.3	2.0
	50.0	98.2~102.7	1.7
安赛蜜	5.0	97.5~102.9	2.8
	10.0	97.9~101.8	1.9
	50.0	98.5~102.7	1.7
咖啡因	5.0	97.1~102.5	2.5
	10.0	98.0~102.1	2.1
	50.0	97.9~103.0	2.6

在实测FAPAS 可乐样品并取得结果后(具体结果见3.3), 取FAPAS 可乐样品0.5 mL 进行自身加标试验, 按照样品实测浓度的约1/2 水平处进行自身加标回收率测定,故苯甲酸、糖精、安赛蜜、咖啡因加标浓度依次分别为60、30、30、50 mg/L, 按2.2.2 项下进行前处理后, 按2.2.3 项下色谱条件进行测定,平行制备6 份进行测定, 结果见表3。自身加标回收率结果为97.1%~102.2%, RSD 为0.7%~2.3%。
表3 自身加标回收率和精密度(n=6)

化合物	自身加标量(mg/L)	回收率(%)	RSD(%)
苯甲酸	60	99.3~101.4	0.7
糖精	30	97.6~101.9	1.9
安赛蜜	30	97.1~102.2	2.3
咖啡因	50	98.4~101.7	1.7

3.3 样品分析

本实验室将本方法应用于 FAPAS 组织的能力验证可乐样品测定, 标准品和样品色谱图见图1、图2。本次能力验证全球共有107 个实验室参加, 本实验室通过本方法上报的测定结果与FAPAS 组织统计的中值基本一致, 结果满意, 见表4。本实验室上报结果为苯甲酸115 mg/L、糖精53.1 mg/L、安赛蜜53.3mg/L、咖啡因97.9 mg/L, Z 值分别0、-0.1、0、0, 结果说明本方法色谱分离无干扰, 定量准确, 可满足国际实验室能力验证测定的较高要求, 更可满足常规样品的检测需求。
表4 本实验室参加FAPAS国际比对可乐中测定结果(n=6)

化合物	本实验室测得值 (mg/L)	全球实验室均值 (mg/L)	Z 值
苯甲酸	115	115.4	0
糖精	53.1	53.7	-0.1
安赛蜜	53.3	53.2	0
咖啡因	97.9	97.6	0