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一次能力比对有关茶叶农残净化方法的小结

lindatalent123

2016/12/27

前段时间做了一次绿茶中氯氰菊酯的能力比对，总共用了一个星期的时间，试用了6种净化方法，比较了方法的回收率及精密度等技术参数，特记录如下：
所用仪器：Agilent 7890A
仪器参数：色谱柱：HP-5，60m*0.32mm ID*0.25um，也选用过DB-1及DB-1701的色谱柱，但峰形均没有HP-5的这根色谱柱上的峰形理想。
仪器方法：升温程序：40℃保持1min，30℃/min升温至130℃,5℃/min升温至250℃，以10℃/min升温至300℃，保持 5min。进样口温度：280℃。氯氰菊酯的出峰情况如下图所示。在这个升温程序下，氯氰菊酯的峰正好在基线平稳时出现，避免了由于升温时漂移而影响峰形。

定量方式：外标法，由于氯氰菊酯的3个峰无法完全分开，在积分时将3个峰打包进行处理。GB/T 23204采用了内标定量，净化方法一的最后定量方式为内、外标同时考察。

主要试剂：丙酮、正己烷、乙腈、无水硫酸钠、甲苯
提取方法：由于此次茶叶中的氯氰菊酯浓度较大，以20mL乙腈振荡提取，重复4次以上，最后定容至100mL。净化时酌情取适量进行净化，计算时再考虑稀释浓度。
标准溶液的配制：氯氰菊酯（液标，坛墨质检）取空白基质的绿茶样品进行相同的前处理，最后以已知浓度的标准溶液定容，并上机检测其浓度。因检测浓度与真实浓度偏差小于15%，则暂时不考虑基质效应的影响，以正己烷作为配制溶剂。
质控方式：1、加标：称取一定质量的氯氰菊酯（固标，Dr）以甲苯稀释，准确称取5g(精确至0.0001g)空白基质绿茶,以此标准溶液进行加标，加标浓度分别为20ug, 40ug和50ug。
2、质控样：采用中国计量院绿茶农残质控样，真值为0.434mg/kg。
净化方法1：参照GB/T 23404的方法，在Cleanert TPT固相萃取柱中加入约2cm高无水硫酸钠，用10mL乙腈-甲苯预洗Cleanert TPT固相萃取柱，弃去流出液，下接鸡心瓶，放入固定架上，将一定体积的样品液转移至Cleanert TPT固相萃取柱中，以25mL乙腈-甲苯洗涤小柱，收集上述所有流出液于鸡心瓶中，40℃水浴旋转浓缩至约0.5mL，加入5mL正己烷进行溶剂交换，重复两次，当样液体积不足1mL时，将其转移至有刻度线的1.5mL样品瓶中，最后使样液体积约为1mL，加入40uL内标溶液（环氧七氯），再以正己烷定容至1mL。混匀，上机。
净化效果考察：电话咨询了该方法的开发人员，称该方法对绿茶中氯氰菊酯的回收率达到了99%以上，但就我们所得到的回收率和精密度来看，回收和平行性均极为不佳。有几个原因可能导致了该方法回收率不理想：1、由于过柱极慢（作一个样品至少过柱花去的时间为一个下午），曾用剪去的吸耳球进行吹挤，有可能造成了净化不完全。2、由于最后以样品瓶的刻度线进行定量，可能会造成一定的误差。3、GB/T 23204是一种针对较多农残的高通量检测方法，乙腈和甲苯在洗脱目标物的同时，也洗脱下了大量的杂质。
净化方法2：同样采取该小柱，丙酮：正己烷（2:8）活化，但洗脱溶剂改为了丙酮：正己烷（1:1），少去溶剂交换这一步，浓缩至近干，定容上机。外标法定量。
净化效果考察：和净化方法1相似，这个方法的缺点也是特别慢。采购标准中的贮液器十分有必要。标准的开发人员建议以2-3秒/滴用吸耳球进行挤压，但最后的回收率及质控样结果均不理想，净化没有达到目的。
净化方法3：采用QuEChERS方法，净化管的规格为2mL,其中试剂包的成分是50 mg PSA, 50 mg gc-e，150 mg MgSO4, 50 mg C18。取1mL 提取液加入试剂包混匀，振荡 2分钟后高速离心，提取上清液直接上机。
净化效果考察：回收率在80%-85%之间。由于乙腈极性较大，容易对弱极性的柱子造成流失，因此该方法慎选。
净化方法4：采用Tea Column小柱，和净化方法1基本类似，在浓缩那一步后直接旋至近干，省去溶剂交换，加入1mL正己烷定容后上机。
净化效果考察：回收率均在95%-105%之间，质控样的值与真值偏差小于10%，净化效果较好。
净化方法5：采用gcB小柱，预先用5mL正己烷：丙酮（1:1）活化，将提取液加入到活化的SPE小柱中，用10mL正己烷：丙酮（1:1）洗脱，收集全部过柱的洗脱液，浓缩至近干，以1mL正己烷定容后上机。
净化效果考察：回收率在103%-106%之间。质控样的值与真值偏差小于10%，净化效果较好。
净化方法6：采用gcB/NH2小柱，预先用5mL乙腈：甲苯（3:1）活化，将提取液加入到活化的SPE小柱中，用15mL乙腈：甲苯（3:1）（1:1）洗脱，收集全部过柱的洗脱液，浓缩近干，以1mL正己烷定容后上机。
净化效果考察：回收率在105%左右。质控样的值与真值偏差小于10%，净化效果较好。
当完全不净化将提取液直接上机，得到的回收率均高于125%，因此一定的净化手段还是必要的。
待测样色谱图如下：

综上所述，净化方法4、5、6的净化效果均较理想。这些净化方法的步骤相似，所用时长相仿，建议在做能力比对的时候可以多用几种方法进行比较以确认最终结果。另外，基质效应此次并未进行考察。质控样的浓度比实测样的浓度低了十倍。在这种情况下，浓缩倍数是否影响了基质效应从而导致结果的不准确还有待证明。考虑到加标的浓度与待测样的浓度水平基本保持一致，可将加标的回收率与质控样和真值的偏差结果综合起来对结果的准确性进行考察。

附件：

一次能力比对有关茶叶农残净化方法的小结.docx

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zyl3367898

第1楼2016/12/28

应助达人

楼主的试验很全面，做了6种净化方法，它们的基质效应如何？加标回收率如何？

0

zyl3367898

第2楼2016/12/28

应助达人

内容再丰富些，可以去发表论文。

0

lindatalent123

第3楼2016/12/28

非常谢谢张老师的肯定！哈哈。基质效应是从3个方面考虑的：1、用空白基质样品进行前处理后再以已知浓度的标准物质进行定容，考察结果的偏差较小。2、寄来比对样品时并未寄空白样品，大胆假设其基质效应可以忽略。3、减小基质效应的最主要方法之一就是稀释样品的浓度，我们在前处理提取这个步骤时将样品稀释了一百倍。
zyl3367898(zyl3367898) 发表:楼主的试验很全面，做了6种净化方法，它们的基质效应如何？加标回收率如何？

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分
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lindatalent123

第4楼2016/12/28

净化方法1-2的加标回收率均不尽人意。净化方法3的加标回收率在80-90%之间。净化方法4-6的加标回收率均在90%-110%之间。
zyl3367898(zyl3367898) 发表:楼主的试验很全面，做了6种净化方法，它们的基质效应如何？加标回收率如何？

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zyl3367898

第5楼2016/12/29

应助达人

好办法，有猜测，也有稀释一百倍的动作，这样就把基质效应消除了。
lindatalent123(lindatalent123) 发表: 非常谢谢张老师的肯定！哈哈。基质效应是从3个方面考虑的：1、用空白基质样品进行前处理后再以已知浓度的标准物质进行定容，考察结果的偏差较小。2、寄来比对样品时并未寄空白样品，大胆假设其基质效应可以忽略。3、减小基质效应的最主要方法之一就是稀释样品的浓度，我们在前处理提取这个步骤时将样品稀释了一百倍。

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zyl3367898

第6楼2016/12/29

应助达人

好办法，有猜测也有稀释一百倍的动作，这样消除了基质效应。
lindatalent123(lindatalent123) 发表: 非常谢谢张老师的肯定！哈哈。基质效应是从3个方面考虑的：1、用空白基质样品进行前处理后再以已知浓度的标准物质进行定容，考察结果的偏差较小。2、寄来比对样品时并未寄空白样品，大胆假设其基质效应可以忽略。3、减小基质效应的最主要方法之一就是稀释样品的浓度，我们在前处理提取这个步骤时将样品稀释了一百倍。

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DeeperBlue

第7楼2017/01/12

应助达人

稀释100倍，会不会有些很微量的目标就检不出了？

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zyl3367898

第8楼2017/01/12

应助达人

稀释倍数太大，微量的农药就检不出了。

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肉肉

第9楼2017/05/27

麻烦问一下，您那边的净化方法的净化柱的厂家是谁家的，我这边刚刚开始做农残检测，我用TPT净化柱后，联苯菊酯的回收率很高，在200%左右，也不知道什么原因造成的，但是同样的方法（最后氮吹后溶解液不一样），吡虫啉的回收率就特别低，很痛苦。

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豌豆1982

第10楼2017/12/21

老师，我做茶叶23204，用的是安谱茶叶小柱，结果加正己烷的时候，有白色絮壮物。这种情况，您见过吗

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