第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会 墙报展示（二）

第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会 墙报展示（一）

——柱切换方法对红霉素软膏的高灵敏度检测

关键词：柱切换方法、红霉素软膏含量分析、快速提取

【背景介绍】

红霉素是一种常见大环内酯类抗生素，对葡萄球菌属、各组链球菌和革兰阳性杆菌均具抗菌​活性。奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、百日咳鲍特氏菌等也可对其敏感。对军团菌属、胎儿弯曲菌、某些螺旋体、肺炎支原体、立克次体属和衣原体属也有抑制作用，因此临床应用广泛。
红霉素软膏为红霉素的一种外用制剂，红霉素含量仅1%，辅料为液状石蜡、羊毛脂、黄凡士林。传统前处理手段通常为使用石油醚溶解后，再用磷酸缓冲盐溶液多次萃取，操作复杂耗时耗力。并且由于红霉素为末端吸收，使用UV 215nm进行检测，检测灵敏度较低，为满足定量分析要求，通常需要使用大剂量软膏进行前处理，因此也导致回收率不理想。
本实验一方面通过柱切换系统的应用，同时实现了红霉素软膏在线前处理和在线富集功能，达到约100ppb检出限，另一方面直接使用热水进行简单样品前处理，得到良好回收率，经济环保。

【仪器・方法】

1.色谱条件
采用资生堂CAPCELL PAK C18 MGII S5; 2.1mm×50mm作为前处理柱，CAPCELL PAK C18 MGII S5; 2.1mm×150mm作为分析色谱柱。
前处理流动相为25mmol/L磷酸氢二铵（磷酸调pH=8.2）/乙腈=65/35。
分析流动相为25mmol/L磷酸氢二铵（磷酸调pH=8.2）-乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如表1。
柱温35℃，进样量100μL，PDA 215nm检测。

▲表1 梯度洗脱表
Tab.1 Gradient elution program

2.供试品溶液的制备

★热水直接提取法
取红霉素软膏0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密称量加入100mL超纯水后，称定并记录重量，水浴加热至80摄氏度，震荡混匀后温水超声5min，再次称定补足缺失重量。
离心10min（3000rpm/min），取下层清液用微孔滤膜（0.22μm）滤过，待进样分析。
★石油醚提取法
取红霉素软膏0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80mL石油醚，震荡使红霉素软膏充分分散后，转移至分液漏斗，加入20mL石油醚清洗锥形瓶一并转移至分液漏斗。
加入磷酸缓冲盐溶液（25mmol/L磷酸氢二铵，磷酸调pH=8.2），分四次提取后，定容至100mL，摇匀后用微孔滤膜（0.22μm）滤过，待进样分析。

3.柱切换条件

为实现红霉素软膏的低浓度检测，0-2.5min阀A状态下进样100μL进行样品在线前处理及富集，2.5-15min阀B状态对样品进行梯度洗脱并检测，装置流路图见图1。

▲图1 阀切换流路图

Fig.1column-switching program

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★低死体积构造
1.0μL ，降低柱切换时的时间延迟，减少扩散
★化学惰性构造
接液处使用PEEK树脂，对于容易吸附在金属上的蛋白质或生理活性物质也能有效分析
★最适合多目的复杂流路分析
有1连和2连两种切换系统，可根据分析目的来进行选择
★可独立使用
能接受其他公司仪器系统的Start信号并启动自带程序，可作为该系统的一部分进行使用
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【实验・结果】

不使用柱切换系统直接分析结果如上图，1.5-5min出现大量杂质峰，且红霉素峰前后杂质峰较多，红霉素峰形较差。

而使用柱切换系统分析时，实际样品中的大量杂质在前处理柱中被冲出，实现了在线前处理功能，从而保护了分析柱。达到检量限0.097μg/mL，同时红霉素得到浓缩，峰形更加尖锐，与前后杂质峰分离度分别为1.72和2.14。

【方法学验证】

1.线性关系、定量限考察

精密吸取系列浓度标准对照品溶液100μL注入液相色谱仪分析测定。以每个对照品质量浓度为横坐标(ρ, ng/mL)，以相应的色谱峰面积为纵坐标(y)，拟合标准曲线。
本实验以信噪比(S/N)为10 时对照品的质量浓度为定量限(LOQ)，信噪比为3时对照品的质量浓度为检出限(LOD)。
回归方程、线性范围、相关系数、LOD及LOQ结果见表2。

▲表2 红霉素对照品的线性方程、相关系数、线性范围、定量限及检出限

Tab.2 The linear equations, correlation coefficients, linear range, LOQ and LOD of erythromycin

2.精密度试验

精密吸取混合对照品溶液100μL，连续进样6次，记录各色谱峰的峰面积计算精密度。精密吸取同一混合对照品溶液100μL，连续进样6次，连续测定3天，记录各色谱峰的峰面积，计算日间精密度。
计算结果：RSD为1.29%，日间精密度为1.18%，表明建立的方法精密度良好。

3.重复性试验

分别取三种红霉素软膏，精密称取0.5g，共6份，按“热水直接提取法”制成供试品溶液，进样100μL。三种红霉素软膏分析结果如表3所示，结果表明该方法重现性良好。

▲表3 三种红霉素软膏样品含量及重复性

Tab.3 The mean content and RSDs of erythromycin in erythromycin ointment

4.回收率试验

取红霉素软膏，称取0.5g，共6份，精密加入对照品储备溶液1mL，按供试品溶液制备方法制备供试溶液并进行分析测定。

▲表4 红霉素软膏中红霉素的回收率试验数据, n=6,x±s

Tab.4 Recovery data for erythromycin in erythromycin ointment, n=6,x±s

【总结】

本次实验通过柱切换系统实现样品在线前处理和浓缩，检出限达到0.097μg/mL，实现了红霉软膏中红霉素的低浓度检测。
同时，对样品前处理方法进行简化，直接使用热水提取即可得到96%以上的良好回收率。
比较传统石油醚提取方法，热水提取操作简单便捷，专属性强，灵敏度高，经济环保。