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多功能化净化柱-液相色谱法测定黄曲霉毒素含量

贞正分析

2017/07/31

私聊

液相色谱（LC）

摘要：黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的次生代谢产物，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染的花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素，是我国食品安全风险监测的主要监测对象。本文采用多功能净化柱-液相色谱法对玉米粉质控物样品中的黄曲霉毒素进行检测，实验结果表明：该方法回收率稳定、灵敏度高，RSD均小于5%。
关键字：黄曲霉毒素多功能净化柱-液相色谱检测方法
随着世界经济发展、生活水平提高，人们对于食品对生命安全和身体健康的影响越来越关注。在众多的食品污染因素中，生物毒素是最重要的污染物之一，而黄曲霉毒素因其对人及动物肝脏的剧烈损害名列毒性之首，一直受到人们和食品安全监督机构的广泛关注。
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲菌产生的一种结构类似的二呋喃香豆素衍生物，主要有B1、B2、G1和G2四种形态。其除具有致癌性、致突变性和致畸性外，还会引起肝细胞变性和坏死，是至今发现的毒性最大的真菌毒素。
黄曲霉毒素的检测方法最初以薄层层析法为主，但是薄层层析法存在操作步骤多、样品前处理繁琐、提取和净化效果不够理想、提取液中杂质较多、灵敏度低、重现性差、不能准确定量等缺点。后发展荧光分光光度法，其存在检测费用较高、需配备专门设备、不能对单一毒素进行检测的缺点，此外张雪辉等比较了用荧光光度法和溴衍生-高效液相色谱法检测中药中黄曲霉毒素的结果，发现存在假阳性。免疫分析法是利用抗原抗体特异性反应等来测定黄曲霉毒素含量的方法，该方法的缺点是：重复性差，试剂寿命短，存在假阳性。目前黄曲霉的检测一般采用高效液相色谱法，兼具定性、定量的特点。
本文采用一种多功能净化柱-液相色谱法对玉米粉质控物样品中的黄曲霉毒素进行检测，先将样品提取液过自制多功能净化柱进行过滤，将过滤液进入液相色谱仪进行分析检测。该方法与其他黄曲霉毒素检测方法相比，具有耗时短、灵敏度高、操作简单、价格低廉、易于保存等优点。
1.样品的提取与净化
1.1 实验试剂与仪器
多功能净化柱，青岛贞正分析仪器有限公司；阴性玉米粉质控物；光化学柱后衍生设备；离心机；超声波清洗机；高效液相色谱仪，Waters2695；甲醇、乙腈，色谱纯；超纯水；黄曲霉毒素标准品（B1、B2、G1、G2）。
1.2 样品的提取
称取5g阴性玉米粉质控物样品进行研磨，加入25mL 84/16乙腈/水，将样品进行超声，时间为60min，中间每隔10min摇晃一次，然后将样品离心处理，6000r/min离心10min，取上清提取液。
1.3 样品的净化
将上述上清提取液至于试管中，过自制多功能净化柱进行过滤，注意过柱速度要小于2mL/min，提取过滤后液体于样品瓶中，做好标记。
2. 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2工作曲线的测定
分别配置梯度浓度的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2溶液，用液相色谱仪进行检测，得到黄曲霉毒素B1工作曲线，如图1所示。液相色谱条件：流动相：A相，水；B相，乙腈+甲醇（50%+50%）；等梯度洗脱条件：A，68%；B，32%；色谱柱：C18柱（柱长150mm或250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm）；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：50μL；光化学柱后衍生器：激发波长：360nm；发射波长：440nm。

图1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2工作曲线

3.基质空白值测定结果
依据《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》 GB 5009.22-2016 方法，对阴性玉米粉质控物样品进行提取、净化、检测。

表2 空白值测定结果

空白测定次数（n）	峰面积	浓度（mg/L）
1	0	0
2	0	0
3	0	0
平均值	0

4.方法评价结果
依据《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》 GB 5009.22-2016，对试剂空白加标，加标水平为2ppb，对阴性玉米粉加标，加标水平分别为0.5ppb、2ppb、5ppb。

表3 试样测定结果

		B1		B2		G1		G2
		回收率	RSD	回收率	RSD	回收率	RSD	回收率	RSD
试剂加标（2ppb）	1	93.13	3.36	95.60	2.46	92.73	3.91	98.07	2.38
	2	100.28		100.16		100.44		98.44
	3	98.76		97.86		99.46		99.12
	4	98.02		99.93		93.09		92.81
	5	97.82		98.74		99.09		96.61
	6	92.24		94.17		92.71		95.82
基质加标（0.5ppb）	1	64.40	3.97	70.46	3.87	78.92	4.31	73.43	4.89
	2	60.80		67.21		77.63		79.60
	3	57.53		65.32		75.80		75.14
	4	62.46		72.38		82.59		80.17
	5	59.36		71.56		75.16		76.85
	6	60.03		69.67		83.25		83.96
基质加标（2ppb）	1	75.59	3.25	81.29	3.54	82.07	4.62	82.05	4.31
	2	73.30		79.14		75.16		79.44
	3	71.36		80.80		80.06		81.56
	4	75.81		83.16		81.36		81.28
	5	70.91		81.44		81.53		76.06
	6	70.48		74.98		73.60		73.70
基质加标（5ppb）	1	85.29	3.27	89.74	2.90	100.80	4.80	92.30	3.02
	2	90.27		95.90		109.18		92.65
	3	87.58		93.70		108.12		93.29
	4	90.80		95.68		97.19		85.75
	5	93.57		94.54		107.71		90.93
	6	91.40		90.16		100.78		90.19

5.结论

该多功能净化柱适用于玉米粉物质的检测，通过对检测方法精确度、准确度的评价，回收率57%-110%之间，RSD＜5%，满足玉米粉基质中黄曲霉毒素的检测。
参考文献

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