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HPLC分析方法开发关键参数-化合物pka和流动相pH

牛一牛

2017/08/01

化学药检测

因为在一起工作相处的时间比较久了，所以偶尔就有同仁问到让我很难解释清楚的问题，针对HPLC方面的比较多的是：你为什么用这个流动相，你怎么知道就一定要调节pH到3.5或2.5，诸如此类的问题，一句话两句话还真的难以解释清楚，想解释，但难于表达，还是以文字的形式表述更清晰。
在药物分析这一块，化学药，平时接触到的绝大部分是弱酸性或弱碱性的药物。
路易斯酸碱理论，大家都懂，Herderson-Halselbalch公式也许并不陌生，本人习惯称之为“H-H公式“，表述为：

先撇开化学方面的因素，从数学方面入手，对于一个弱酸，当pH高于或低于pKa两个单位时，化合物99%以一种形式存在。
反相色谱，简言之即流动相极性大于固定相极性的色谱，对于可电离的化合物，要想获得强的反相保留，尽可能不电离，因为化合物一旦电子，极性会变大，不电离时极性最小，极性小，在反相色谱柱上保留就强。对于HPLC分析方法开发，对反相色谱而言，化合物有保留是前提。
比如，一个弱酸性化合物，pKa为5.0，那么，当流动相（缓冲液）pH调节为3.0时，99%的化合物是以弱酸形式存在的，即HA形式，此时，化合物极性相对较小，保留较强；另一方面，对于HPLC来讲，以一种形式存在的化合物，可以获得较好的尖锐的峰。
对于为什么选择某一种缓冲体系，其实还是根据化合物本身的pKa而定。
缓冲体系，简单分，三类：
弱碱及其对应的盐，如NH3-NH4CL;
弱酸及其对应的盐，如HAc-NaAc；
多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如K2HPO3-K3PO3。
工作中，常用的缓冲盐，绝大部分为磷酸盐或醋酸盐，这就限定了流动相的组成。举例，一个弱酸性化合物，pKa为5.0，可以选择磷酸盐体系，然后用磷酸调节pH至3.0即可，大局就定了。
说了这么一大串，最关键的参数依然是pKa,这个参数在HPLC分析方法开发中有着举足轻重的地位。
以上仅为个人总结观点，愿对各位坛友有所帮助。

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Kevin

第1楼2017/08/02

感谢牛老师无私分享~~~~

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牛一牛

第2楼2017/08/02

应助达人

分享后就不用回复私信了，人懒。
Kevin(m3163882) 发表:感谢牛老师无私分享~~~~

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joysdick

第3楼2017/08/25

知道会用pKa来开发方法，基本上是有一定经验的了，但只是第一步，流动相pH选择和pKa有什么联系，对于多个pKa或者同时具有多个酸碱中心，该怎么选择pH缓冲盐种类，不同的缓冲盐对应的最佳PH缓冲范围，碱性化合物怎么应对，再进一步的离液试剂，离子对试剂，色谱柱碳链长度，固定相杂化种类……pKa是打开方法开发大门的钥匙，另外文中说到99%化合物以弱酸形式存在，可能只是对于楼主平日工作所接触到的而言，其实更多的是弱碱或者同时有酸碱性的化合物

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云雀

第4楼2017/11/17

欢迎分享工作中的心得体会~
joysdick(joysdick) 发表:知道会用pKa来开发方法，基本上是有一定经验的了，但只是第一步，流动相pH选择和pKa有什么联系，对于多个pKa或者同时具有多个酸碱中心，该怎么选择pH缓冲盐种类，不同的缓冲盐对应的最佳PH缓冲范围，碱性化合物怎么应对，再进一步的离液试剂，离子对试剂，色谱柱碳链长度，固定相杂化种类……pKa是打开方法开发大门的钥匙，另外文中说到99%化合物以弱酸形式存在，可能只是对于楼主平日工作所接触到的而言，其实更多的是弱碱或者同时有酸碱性的化合物

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云雀

第5楼2017/11/17

pKa对于药物研发确实太重要了，不仅分析方法开发要用，溶出介质选择要用，制剂处方筛选有时也要考虑

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牛一牛

第6楼2017/11/18

应助达人

药物分析版面需要你强有力的支持，
请多多发言，分享是一种美德。
joysdick(joysdick) 发表:知道会用pKa来开发方法，基本上是有一定经验的了，但只是第一步，流动相pH选择和pKa有什么联系，对于多个pKa或者同时具有多个酸碱中心，该怎么选择pH缓冲盐种类，不同的缓冲盐对应的最佳PH缓冲范围，碱性化合物怎么应对，再进一步的离液试剂，离子对试剂，色谱柱碳链长度，固定相杂化种类……pKa是打开方法开发大门的钥匙，另外文中说到99%化合物以弱酸形式存在，可能只是对于楼主平日工作所接触到的而言，其实更多的是弱碱或者同时有酸碱性的化合物

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工大色谱中心

第7楼2017/11/22

从分析方法开发这块来看，我更想知道的是流动相梯度的设定，这方面有什么技巧可以探讨下吗？

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花琦日夏

第8楼2018/04/26

牛老师，您好，如果化合物存在两个pKa，高效液相法分析该化合物时流动相的pH该如何选择？

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Insp_208ad154

第9楼2018/04/27

感谢老师无私分享

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牛一牛

第10楼2018/04/29

应助达人

那就是二元弱酸或弱碱了，原则还是抑制解离，一样的道理。
花琦日夏(v3100361)发表:牛老师，您好，如果化合物存在两个pKa，高效液相法分析该化合物时流动相的pH该如何选择？

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