辣椒油、辣椒酱等调料中苏丹红测定解决方案（改进GB/T19681-2005方法）
1、适用范围
适用于辣椒油、辣椒酱等调味剂中苏丹红的检测。
2、苏丹红标准溶液的配置
分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ各1.0 mg，用3 mL乙醚溶解后用丙酮定容至100 mL，所得苏丹红标准品母液的浓度为10 μg/mL。然后将母液用乙腈稀释至1.0 μg/mL。（此处如果采用国标方法用正己烷定容，进色谱分析会导致苏丹红色谱峰型不够理想，因为后续的液相方法是反相色谱法，流动相含有水，因而与正己烷不互容）。
3、提取步骤
将0.500 g样品置于15 mL 离心管，加入4 mL正己烷，涡旋混合1 min，充分混匀，待净化。（由于辣椒油油脂含量高，需要用到月旭公司去除油脂净化小柱；如果油脂含量比较低或者无油脂，可直接用月旭苏丹红专用柱）。
4、SPE净化步骤
SPE柱：月旭Welchrom® SDH-2苏丹红专用柱，规格500 mg/6 mL（本苏丹红专用柱分为两个部分：即上端的去除油脂小柱，命名为1号柱；和下端的吸附保留苏丹红小柱，命名为2号柱。将1号柱用转接头接在2号柱上面串联使用）
a)活化：加入5 mL正己烷活化Welchrom® SDH-2苏丹红专用柱，流出液弃去，注意不要让小柱溶剂流干。
b)上样：将提取液加入Welchrom®苏丹红专用柱中，并用1mL正己烷润洗离心管一并加入小柱，流出液弃去，注意不要让小柱溶剂流干。
c)淋洗：用5 mL正己烷淋洗小柱，弃去淋洗液并抽干小柱。
d)洗脱：弃去上面的1号小柱，用5 mL乙酸乙酯洗脱下端的2号小柱，收集洗脱液，并将2号小柱抽干。
e)浓缩：将收集的洗脱液在40度加热条件下氮吹至近干，大概剩下一滴液体左右，然后用乙腈复溶并定容到1 mL，过0.22 μm PTFE滤膜，上高效液相色谱仪检测。
5、注意事项
（1）如果采用国标方法用正己烷定容，进色谱分析会导致苏丹红色谱峰型不够理想，因为检测四种苏丹红的液相方法是反相色谱法，流动相含有水，因而与正己烷不互容。
（2）加标过程：取50 μL和100 μL 1.0 μg/mL的标样加入到0.5 g样品中，加标浓度即为0.2 mg/kg。加标的体积不能超过100 μL，因为标样用乙腈稀释，会存在乙腈和提取试剂正己烷的相容性不好的问题。
（3）本方法使用串联小柱，目的是为了尽可能多地去除各种样品里面存在的油脂，保证本方法对大多数样品均有较好的适用性。
（4）在过SPE小柱的过程中，“活化”和“上样”这两个步骤要注意不要使得小柱干涸，这样会影响小柱的回收率。而在“淋洗”和“洗脱”这两个步骤要注意抽干小柱，以便尽可能多的去除杂质和得到目标物。
（5）洗脱液在氮吹浓缩的过程中，注意不要将洗脱液完全吹干。因为这样有可能会影响回收率。
（6）过柱的流速不要太快，本实验可以采用重力自然过柱的方式。除了在“淋洗”和“淋洗”这两个步骤要需要抽干小柱可以抽负压外，其他步骤均采用重力自然过柱即可。
图1：月旭Welchrom®SDH-2苏丹红专用柱串联使用的连接方法（上端的1号为去除油脂小柱，下端的2号小柱为吸附和保留苏丹红目标物的小柱）
6、月旭Welchrom®SDH-2苏丹红专用柱过柱效果图
图2：月旭Welchrom®SDH-2苏丹红专用柱过柱效果图（A: 活化；B: 上样；C: 淋洗；D: 洗脱）
7、色谱条件
色谱柱：月旭Ultimate®XB-C18（4.6 x 250 mm, 5 μm）
流动相：乙腈/水 =95/5（混成一相）
流速：1.0 mL/min
进样量：20 μL
柱温：30 oC
检测波长：500 nm
8、色谱图或者加标回收率结果
图3：乙腈溶剂色谱图
图4：实际辣椒酱样品色谱图
图5：苏丹红Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ,Ⅳ标准品色谱图（苏丹红Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ加标浓度均为: 0.05 mg/kg）
图6：实际辣椒酱样品加标色谱图（苏丹红Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ加标浓度为: 0.1 mg/kg）
图7：苏丹红Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ标准品色谱图（苏丹红Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ加标浓度为: 0.1 μg/mL）
图8：实际辣椒酱样品加标色谱图苏丹红Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ,Ⅳ标准品色谱图（苏丹红Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ加标浓度为: 0.2 mg/kg）
表1：加标回收率测定结果
9、结论
使用月旭Welchrom® SDH-2苏丹红专用柱可以快速、高效检测辣椒油、辣椒酱等调味品中的四种苏丹红，方法的灵敏度高，重现性好，克服了GB/T19681-2005方法存在的前处理方法繁琐，不稳定、重现性不理想等众多问题。
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