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高效液相色谱法同时测定饲料中维生素A和维生素K3的失败经历

有水有渝

2017/09/29

液相色谱（LC）

前段时间拿到一个饲料样品，要检测饲料中维生素A和维生素K3，看标准两者用的流动相都是甲醇-水，第一反映就是不是可以梯度洗脱同时测定两个成分，采用定时变换检测波长的方法实现检测。结果很失败，在此分享一下分析过程。
先看标准方法：
GB/T 17817-2010 饲料中维生素A的测定高效液相色谱法

GB/T 7294-2009 饲料添加剂亚硫酸氢钠甲萘醌（维生素K3）

GB/T 18872-2002 饲料中维生素K3的测定高效液相色谱法
维生素K3的检测原理是在碱性条件下，水溶性的亚硫酸氢钠甲萘醌脱去亚硫酸氢钠生成脂溶性的甲萘醌，用三氯甲烷萃取，吸取适量经甲醇稀释后上机检测。

一、第一次实验：按标准维生素K3的提取过程太麻烦了，且三氯甲烷并不是随便可以买到，那能不能像维生素A一样直接甲醇提取后检测？
1、查维生素K3（亚硫酸氢钠甲萘醌）理化特性:易溶于水和热乙醇，难溶于冰乙醇，不溶于苯和乙醚，水溶液PH4.7-7.常温下稳定，遇光易分解。看下面的结构式：

看性质肯定可以溶解在90%甲醇-水里，取亚硫酸氢钠甲萘醌适量，在棕色容量瓶中90%甲醇溶解后上机检测。
2、结果出峰极快，受亚硫酸根强极性基团的影响，维生素K3在反相色谱上完全不保留且峰形很差，说明不能直接提取后上机检测，第一次以失败告终。

二、第二次实验：老实的按标准方法（GB/T 18872-2002 饲料中维生素K3的测定高效液相色谱法）？显然不好，还是不能同时测定维生素A和维生素K3，能不能碱性条件下脱亚硫酸氢钠后纯甲醇提取后上机检测呢？
1、由于维生素A的提取方法是65度纯甲醇超声提取30分钟，那么就先取适量维生素A和维生素K3置100mL棕色容量瓶中，由于手上没有氢氧化铵，所以加入5mL碳酸钠溶液代替，加入后超声振摇1min，即有白色沉淀析出（可能是碳酸钠与甲萘醌的混合物），立即加入80mL甲醇，65度超声提取30分钟，过滤取，取滤液稀释至合适浓度上机检测。
2、结果几乎无甲萘醌峰出现，观察提取液的颜色，基本可以确定是甲萘醌都氧化成了羟基苯醌。如下呈褐色的滤液。第二次失败。

还有一个原因是用甲醇提取与用三氯甲烷提取有明显的区别，是甲醇与碳酸钠溶液是有一定互溶性的，而三氯甲烷与碳酸钠溶液不互溶。甲醇的碳酸钠溶液可能也会促进甲萘醌的破坏。
三、第三次实验
1、实验方法：维生素A与维生素K3分别按标准方法提取，再吸取甲萘醌的三氯甲烷溶液适量置提取好的维生素A提取液中，混匀，上机检测，梯度洗脱程序如下：

2、结果甲萘醌与维生素A可以实现分离与同时检测，但每针的分析时间太长，与分别单独检测维生素A与维生素K3，每针分析时间只要10分钟相比，没有优势，如果还要同时分析维生素D与维生素E的话，分析时间就会更长，另外也有可能存在提取维生素A时有少量甲萘醌生成，造成结果偏高的误差。其它实验证明维生素A、D、E可能在98%甲醇下同时分析。至此，第三次实验也算失败。

　　　　　　　　　　　　　维生素Ｋ3（7.1min）与维生素Ａ(21.4min)同时检测图谱

　　　　　　　　　　　　　　　　维生素Ａ样品图谱（98%甲醇等度洗脱）

　　　　　　　　　　　　　　　维生素Ｋ3样品图谱（80%甲醇等度洗脱）
综上，本次最终还是选择按标准方法分别检测维生素A与维生素K3，在检测维生素K3由标准方法的旋转振荡器改为普通摇床振荡。这次的经验告诉我，要改进方法真的不容易，进行方法开发前一定要充分了解待测组分的理化性质，充分理解参考文献的检测原理与注意事项。看到亚硫酸根有没有人会考虑使用离子对试剂四丁基氢氧化铵和四丁基溴化铵的，估计也是不行的，碱性条件下会水解。

分
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夏天的雪

第1楼2017/09/30

应助达人

感谢分享，好好学习一下

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zyl3367898

第2楼2017/10/02

应助达人

两者前处理方法相差大，不能一次处理同时检测两种的，还需要继续摸索方法。

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有水有渝

第3楼2017/10/05

应助达人

前处理方法确实差异比较大，暂时还没有明确的改进方向，维生素的检测方法最好只要开发成两个，一个是脂溶性的，一个水溶性的。
zyl3367898(zyl3367898) 发表:两者前处理方法相差大，不能一次处理同时检测两种的，还需要继续摸索方法。

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夏天的雪

第4楼2017/10/09

应助达人

色谱方法相似，但是前处理方法不同，也不太好整合

0

hujiangtao

第5楼2017/10/11

应助达人

维生素不好做

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yy_0324

第6楼2018/04/04

测定饲料中维生素有很大难度呀！

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有水有渝

第7楼2018/04/05

应助达人

含量低，测定的平行性不是很好，相对偏差20%都很正常
yy_0324(yy_0324) 发表:测定饲料中维生素有很大难度呀！

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Insm_0421a022

第8楼2018/08/17

维生素K3的提取可不可以不用吹氮仪和旋转蒸发仪，感觉好复杂，可以不用三氯甲烷和碳酸钠溶液提取吗，可以换成其他甲醇乙腈或者无水乙醇提取吗

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有水有渝

第9楼2018/08/17

应助达人

标准上这么写的，我上面试换试剂的结果不好，更改首先要做方法学验证，楼主可以再验证一下。
Insm_0421a022(Insm_0421a022) 发表:维生素K3的提取可不可以不用吹氮仪和旋转蒸发仪，感觉好复杂，可以不用三氯甲烷和碳酸钠溶液提取吗，可以换成其他甲醇乙腈或者无水乙醇提取吗

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