高效液相色谱仪简单使用和分析维护

高秋荣

2018/07/03
国联质检团队

私聊

液相色谱（LC）

高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱仪简单使用和分析[/url]维护

西安国联质量检测技术股份有限公司
安评中心：惠永鹏
总述：
高效液相色谱法是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物的有效方法之一。在已知的有机化合物中，约有80%能用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱法[/url]分离、分析，此法条件温和，不破坏样品，特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。
系统组成：
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。部门内部有一台Agilent公司的高效液相色谱和岛津公司的液相色谱联用质谱仪，基本可以满足部门内部实验分析使用。
一、 输液泵
泵的构造和性能：输液泵是HPLC系统中最重要的部件，性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：流量稳定，其RSD应小于0.5％；流量范围宽，分析型应在0.1～10ml／min范围内连续调，制备型应能达到100ml／min；输出压力高，一般应能达到150～300KG/CM2；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。
泵的种类：按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阴影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，目前应用最多的是柱塞往复泵。
柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱压影响；泵压可达400KG/CM2。ADW主要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好。
二、进样器
一般HPLC分析常用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫子和固定底座组成。耐高压，进样量准确，重复性好，操作方便。六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50％，并要求每次进样体积准确、相同。用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5～10倍，这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。
三、色谱柱
色谱是一种分离分析手段，分离是核心，色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市面上的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10UM等，柱效理论值可达5～16万／米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
四、检测器
HPLC的检测器分为两类：通用型检测器和专用型检测器。
1．通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化，通常采用差分测量法，这类检测器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器等，通用检测器适用范围广，但由于对流动相有响应，因此易受温度变化、流动相和组分的变化的影响，噪声和漂移都比较大，灵敏度较低，不能用梯度洗脱。
2．专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这一性质是流动相所不具备的，或至少在操作条件下不显示。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、放射性检测器等。
简单维护：
流动相及样品:
高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤，且流动相需要定期更换；流动相脱气；样品溶解后，用0.22微米的有机系膜或者水系膜过滤。
泵的维护、保养：
高压恒流泵为整个色谱系统提供稳定均衡的流动相流速，保证系统的稳定运行和系统的重现性。高压输液泵由步进电机和柱塞等组成，高压力长时间的运行回逐渐磨损泵的内部结构。在升高流速的时候应梯度升高，最好每次升高0.2mL/min，当压力稳定时再升高，如此反复直到升高到所需流速。若有堵塞情况可用异丙醇或甲醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。在仪器使用完了以后，要及时清洗管路并冲洗泵，保证泵的良好运转环境，保证泵的正常使用寿命。
色谱柱的维护和保养：
使用的流动相均应为HPLC级，在配置过程中所有非HPLC级的试剂或溶液均经0.22um薄膜过滤，而且流动相使用前都经过超声仪超声脱气后才使用。所使用的水必须是经过蒸馏纯化后再经过0.22um水膜过滤后使用，所有试液均现用现配。并且在进样的样品都必须经过0.22um薄膜针筒过滤后进样。使用到的最大流速为1.0mL/min，所以流速提升过程应是梯度提升，不存在流速的突然升降。仪器检测完，需要用流动相梯度洗脱色谱柱1小时以上。
其它问题：
此外，出现死机可重启计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。

分
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