板栗叶水浸液对商洛丹参幼苗酶活性的影响

高秋荣

2018/07/09
国联质检团队

私聊

中药/天然药检测

板栗叶水浸液对商洛丹参幼苗酶活性的影响

西安国联质量检测技术股份有限公司

食品事业部：魏娜

摘要：本实验以商洛丹参种子为材料，以板栗叶为供体，研究不用浓度板栗叶水浸液对商洛丹参幼苗酶活性的影响。采用生物测定法测定丹参幼苗酶活性的状况。
关键词：丹参，板栗叶水浸液，酶活性
植物化感作用(Allelopathy)是指植物(含微生物)向环境释放特殊的化学物质而对其他植物或微生物产生直接或间接的有害或有益的作用,这些特殊的化学物质叫做化感物质。化感物质一方面通过植物体释放产生,另一方面通过植物地上和地下部分的残体分解产生。化感作用广泛存在于自然界中,它涵盖了各种植物之间、包括微生物间的相生相克关系,对解释植物个体及种间的相互作用机制和构建可持续的植物群落都起着重要的作用,并对农、林业生产有重要的影响,如农作物的连作障碍、森林更新失败以及生物入侵等现象都与化感作用密切相关。化感物质进入土壤后,植物根际微生态系统将发生复杂的变化。化感物质对土壤微生物区系及酶活性的研究,包括根系分泌物数量和成分的变化与土壤微生物类群的关系、土壤酶活性与土壤微生物种类及数量的关系等,这为研究化感作用对土壤根际微生态系统的影响,特别是为根际微生物区系的变化提供了有益的参考。
目前,有关植物某一部位水浸液以及纯化感物质对土壤酶活性、土壤养分和微生物数量影响的相关研究相对较少,已有研究主要包括:黄益宗等研究发现化感物质阿魏酸对土壤硝化反应的抑制作用最强,其次是对叔丁基苯甲酸;吕可等通过用花椒叶水浸液浇灌盆栽花椒幼苗研究水浸液对土壤酶和微生物的影响,结果表明:花椒叶水浸液使根际土中的细菌、真菌和放线菌数量以及微生物总数均有不同程度的减少,使根际土蛋白酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性明显低于非根际土相应的酶活性,而过氧化氢酶和多酚氧化酶活性则显著升高;印楝种子壳的酒精水浸液显著抑制了土壤中放线菌的数量,显著增加了土壤中自由固氮细菌的数量,显著抑制了土壤中反硝化细菌的数量,土壤脱氢酶活性未受到影响,而磷酸酶活性受到了严重的抑制;2,4二叔丁基苯甲酸(PEDT)和香草酸两种化感物质均在低浓度下提高而在高浓度下抑制了微生物生物量及其活力。
板栗（Castanea mollissima Blume）,有较高的药用价值，有健脾胃、益气、补肾、强心的功用。其中所含的丰富的不饱和脂肪酸和维生素，能防治高血压病、冠心病和动脉硬化等疾病。板栗在商洛地区大面积种植,是商洛主要经济林品种之一、五大商药之一、也是商洛的主要经济作物之一。丹参(Salvia miltiorrhiza Bge. )为唇形科鼠尾草属多年生草本植物,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功能。其根及根茎是常用的重要中药，有活血化瘀、消肿止痛、养血安神的功能。丹参根中含有丹参素、丹参酮等生物活性物质，对治疗冠心病、心绞痛和脑血管疾病有很好的疗效，同时还具有抗菌消炎、保肝和改善肾功能的作用。研究不同浓度板栗叶水浸液对商洛丹参幼苗酶活性的影响，对科学构建林药复合系统，合理选择林下中药材品种，提高土地利用率，增加农民收入，促进地方经济发展，不仅具有理论指导作用，还具有非常重要的现实意义。化感作用的研究对农林（林药）复合系统中物种的配置、耕作制度和栽培措施的优化，农田病虫害的控制、复合系统的经营管理，以及保持生物多样性和农业可持续发展有重要意义。在农林（林药）复合系统中，林木会通过淋溶、挥发、残体分解和根系分泌向林下植物释放有益或有害的化学物质，促进或抑制植物的生长和生产，那么合理选择林下作物品种直接影响整个复合系统的总产量和农民的经济收入。研究板栗和丹参之间的化感作用，对林药复合生态系统的构建、管理、经营有着十分重要的意义。
1．材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1实验材料供体材料为板栗叶，采自商州区。受体种子为商洛地道中药材丹参。
1.1.2实验仪器人工气候培养箱、分光光度计、水浴锅、冷冻离心机、制冰机、天枰、真空干燥器
1.1.3实验试剂

1.2 实验方法
1.2.1 板栗叶水浸液的制备。取风干的板栗叶样品，剪成1cm长的小段，按30g/600mL的比例用蒸馏水浸泡，在振荡器上震荡48h（25℃），过滤后即得浓度为0.05g/mL的水浸液(母液)，用蒸馏水将水浸液分别稀释至0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L，置于4℃冰箱备用。
表 1 制作不同浓度的板栗叶水浸液

板栗叶水的浓度（mol/L）	母液(mL)	分别用蒸馏水定容至500mL。
0.01	10
0.02	20
0.03	30
0.04	40
0.05	50

1.2.2 丹参种子萌发及幼苗培养。 取丹参种子先用0.1%HgCL₂消毒10min，浸泡24h。蒸馏水冲洗数次，滤干后均匀排列放至培养皿中，于人工气候培养箱（温度25℃，湿度62°）中培养。从培养的第二天起及时补充等量水浸液和蒸馏水，使滤纸始终保持湿润。
1.2.3 超氧化物歧化酶活性的测定
取丹参种子0.20g，加5ml的mmol/L的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，匀浆液以5000r/min离心15min，按谁谁的比色法（愈创木酚法），测定各组丹参幼苗SOD酶活性，最后以OD470/min·g表示超氧化物歧化酶的活性

实验一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力[]

一、原理
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：植物叶片。
（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。
（三）试剂
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
A母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取Na₂HPO₄·12H₂O （分子量358.14） 71.7g
B母液: 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取NaH₂PO₄·2H₂O （分子量156.01） 31.2g
分别用蒸馏水定容至1000mL；
0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）的配制：
分别取A母液（Na₂HPO₄）228.75mL,B母液（NaH₂PO₄）21.25mL，用蒸馏水定容至1000mL。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
（3）750μmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（4）100μmol/L EDTA-Na₂溶液：称取0.03721g EDTA-Na₂，用磷酸缓冲液定容至1000ml。
（5）20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。
三、实验步骤
1.酶液提取
取丹参幼苗0.5g于研钵中研磨成粉末，加2ml预冷的提取介质在冰浴上研磨成浆，加入提取介质冲洗研钵，提取介质终体积为5ml。取1.5-2ml于4℃下10000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2.显色反应
取5ml指形管或试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：
表2 制作

试剂名称	用量（mL）	终浓度（比色时）
0.05mol/L磷酸缓冲液	1.5
130mmol/L Met溶液	0.3	13mmol/L
750μmol/L NBT溶液	0.3	75μmol/L
100μmol/L EDTA-Na₂溶液	0.3	10μmol/L
20 μmol/L核黄素溶液	0.3	2.0μmol/L
酶液	0.05	2支对照管以缓冲液代替酶液
蒸馏水	0.25
总体积	3.0