原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法验证

高秋荣

2018/07/28
国联质检团队

私聊

液相色谱（LC）

原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法验证报告

GB/T22388-2008（第一法）

李晓东

一、方法概述
1 范围
本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法。
本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。
2 原理
试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器
1.2分析天平：感量0.0001g和0.01g
1.3固相萃取装置
1.4超声波振荡器
1.5氮气吹干仪
1.6涡旋混合器
1.7高速离心机：转速不低于4000r/min。
1.8具塞塑料离心管
1.9研钵
2. 试剂
除非另有说明，本方法所有实际均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1甲醇(CH3OH )：色谱纯。
2.2乙腈(CH3CN) : 色谱纯。
2.3氨水：含量25%-28%
2.4三氯乙酸
2.5柠檬酸
2.6辛烷磺酸钠
2.7甲醇水溶液：准确量取50ml甲醇和50ml水，混匀后备用。
2.8三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
2.9氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5ml氨水和95ml甲醇，混匀后备用。
2.10离子对缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约960ml水溶解，调节PH至3.0后，定容至1L备用。
3. 材料
3.1阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3ml，或相当者。使用前依次用3ml甲醇、5ml水活化。
3.2定性滤纸
3.3海沙：化学纯，粒度0.65mm~0.85mm，二氧化硅（SiO₂）含量为99%。
3.4微孔滤膜：0.2μm，有机相。
3.5氮气：纯度≥99.999%
三、分析步骤
1.标准曲线绘制
1.1 三聚氰胺标品：纯度大于99.9%
1.2标准储备液：准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用甲醇水溶解并定容至刻度，配置成浓度为1mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。
1.3标准工作液：量取标准储备液适量，用甲醇水稀释成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mLng/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL标准工作液。
2.样品的处理
2.1 提取
2.1.1液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
称取2g（精确至0.01g）试样于50ml具塞塑料离心管中，加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超声提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，移取5ml
滤液，加入5ml水混匀后做待净化液。
2.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
称取2g（精确至0.01g）试样于研钵中，加入适量海沙（式样质量的4倍-6倍）研磨成干粉状，转移至50ml具塞塑料离心管中，用15ml三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5ml乙腈，余下操作同2.1.1中“超声提取10min，.......加入5ml水混匀后做待净化液”。
（注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化）
2.2 净化
将3.1中的待净化液转移至固相萃取柱中，依次用3ml水喝3ml甲醇洗涤，抽至净干后用6ml氨化甲醇溶液洗脱，整个固相萃取过程流速不超过1ml/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1ml流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供液相测试。
3.仪器测定条件
3.1色谱柱：C8柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者；
C18柱, 250mm×4.6mm，5μm，或相当者。
3.2流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（85:15，体积比），混匀。
C18柱，离子对试剂缓冲剂-乙腈（90:10，体积比），混匀。
3.3流速：1.0ml/min
3.4柱温：40℃
3.5波长：240nm
3.6进样量：20μl
四、结果处理
分析结果的表述
1、计算公式

式中：X-试样中三聚氰胺的含量mg/kg；
C-标准溶液中三聚氰胺的浓度，μg/mL；
m-试样质量,g；
V-试样最终定容体积，mL；
f-稀释倍数。
五、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
Y=38040.6*X+2468.64 R^2=0.9999026

表1 三聚氰胺标准系列试验结果

C（μg/mL）	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0	100.0
A	32622	45831	178263	374953	971711	1886106	3812576

以上结果表明三聚氰胺在0.5μg/mL ~100.0μg/mL范围内，R=0.9999513,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将0.5μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出三聚氰胺的方法检出限为 0.1mg/kg，此检出限结果满足条件。
七、重复性测定
A.对样品F1807000285进行7次进样，其三聚氰胺测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X_平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0231	11.609	1	28.69	28.85	0.33
2	2.0286	11.701	1	28.84
3	2.0304	11.747	1	28.93
4	2.0294	11.691	1	28.8
5	2.0300	11.745	1	28.93
6	2.0318	11.766	1	28.95
7	2.0272	11.677	1	28.85

本方法的精密度为 0.33% ，符合《原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T22388-2008中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
六、准确度验证（加标回收）
对样品JF180401228加标，取三聚氰胺浓度100 .0 μg/mL的标液 0.12mL、0.20mL和0.4ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		三聚氰胺
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X_平（mg/kg）	加标量（）	回收率%
1#	2.0211	1.0	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0187	1.0	N.D	N.D	N.D	/	/
加标1#	2.0236	1.0	11.747	29.03	/	24.71	97.91
加标2#	2.0224	1.0	20.491	50.66	/	49.45	102.45
加标3#	2.0312	1.0	38.246	94.15	/	98.46	95.62

由上表可以看出三聚氰胺的加标回收范围在 95.62%-117.48% ，RSD值为3.5%符合规定要求。
七、总结
本方法的检出限为0.1mg/kg。小于GB/T22388-2008中给出的最低检出浓度2mg/kg。本方法的精密度为 0.33%，符合《原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T22388-2008中给出的精密度要求.通过对原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺测定方法的检出限、精密度和准确度的评价，本方法测定三聚氰胺数据准确，结果可信。此方法的准确性好，测定结果真实可靠，可用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定。

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方法验证大都如此。

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LC测到一个样品里有一个峰跟三聚氰胺重了，用DAD可以分辨出来不是，但这个怎么做回收呢？有好的梯度推荐吗？

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第4楼2018/09/30

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haggerder(haggerder) 发表:LC测到一个样品里有一个峰跟三聚氰胺重了，用DAD可以分辨出来不是，但这个怎么做回收呢？有好的梯度推荐吗？

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第6楼2023/06/14

您好，在做您这个前处理时遇到一些问题，烦请帮忙解答。1.在称量乳粉时不知道什么原因，用不锈钢勺还是牛角勺都会有静电产生还是因为是塑料离心管的材质引起。2.离心的速度是越大越好么还是在哪个范围内效果最好。3.离心之后的上清液，不同的样品呈现出上清液的清澈程度不同这是什么原因呢？3.净化过程中，样品不同流下来的速度也不同，这速度大概控制在一个怎样的范围内最后的回收率会好一点？做的时候有的滴的速度快，有的滴的速度慢，不太好控制有没有什么好的方法尽量可以解决呢？4.萃取小柱在使用时可以抽干吗？抽干和不抽干对最终结果有哪些影响呢？