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机械力作用下DNA结构变化的实时可视化
QUANTUM量子科学
2018/08/02
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生命科学仪器综合讨论
研究DNA过度拉伸时的结构变化
单分子力谱(SMFS)仪器被广泛用于研究DNA过度拉伸时的结构变化。然而,很多仪器仅仅能够给出大体的信息,然而结构变化的作用机制仍然不明。将SMFS与可视化相结合可以解决这个问题。我们将讨论LUMICKS的C-Trap技术如何将高分辨率的光镊与荧光共聚焦显微结合来检测机械力作用下双链DNA至单链DNA的转变过程。
之前的研究表明,裸露的双链DNA在大约65 pN的力下发生转变。在施加恒定力的转变过程中,DNA的伸直长度增加了70%。接下来DNA的B型至S型转变中,包括若干因终端或缺口被剥开或因融解泡形成而融解的区域。由于DNA的这种行为在65 pN力作用下可以再现,因而可以测量不同的连接配体或不同的缓冲液产生的力导致的过度拉伸时的变化,揭示DNA与连接配体的相互作用如何影响DNA的结构与稳定性。
1 DNA过度拉伸的图示。DNA连接两个被光阱捕获而分开的微球,诱导了两端双链解旋分离。
我们使用高分辨率光镊操控DNA分子引发转变,同时检测力(亚pN级)和距离(亚nm级)随时间发生的变化。我们使用荧光标记来区分已经融解的单链DNA和双链DNA,并用高精度的(误差在15 nm以下)多通道单光子检测来确定融解的位置。使用层流微流控和自动装载功能,可用两个被光阱捕获的微球体来拴住双链DNA(图1)。接下来这个整体被输送至含有浓度为2nM的特异性结合双链DNA的Sytox橙和3 nM的荧光标记的特异性结合单链DNA的复制蛋白A(RPA)的通道中。
2 双链DNA转变至单链DNA的不同阶段的双色二维荧光共聚焦图像。绿色表示特异结合双链DNA的Sytox橙的荧光,蓝色表示特异结合单链DNA的RPA的荧光。
第一个实验中拍摄了不同声力下的荧光共聚焦图像以演示系统的双通道检测功能。首先我们用30 pN的力使双链DNA可见(图2a),碱基对的距离使得Sytox分子可以充分结合并完全包被双链DNA。第二个实验中,施加逐渐上升的声力直到过度拉伸,双链DNA从两端开始剥离。实验中观察到了一个非常明显的与RPA结合到单链DNA的区域(图2,蓝色区域)。除了两端以外的RPA结合的DNA区域显示了从DNA缺口处开始的剥离现象的存在。接下来用C-Trap微流控系统验证了DNA融解区域的存在,并对DNA施以缓慢的垂直流动缓冲液来延长剥下的单链DNA(图2C)。最后,双链DNA被声力完全融解,形成完全被RPA包被的单链DNA(图2D)。
3 单个双链DNA分子以140 nm/s的速度拉伸与收缩的双色荧光波动曲线。将距离(灰色)与力(红色)的数据与荧光图像进行叠加得到数据的真实相关。
为使荧光显微结果与定量力谱数据相符,将单个双链DNA分子以140 nm/s的恒定速度进行拉伸并记录力、距离和荧光(图3)。
灰色的线显示了DNA两端距离随时间的变化,红色的线显示了施加的力随时间的变化。将所有的数据叠加,获得了每一条荧光显微的线的力和距离的值。因此,可以得出Sytox橙最低在25 pN的力下开始结合双链DNA。还有,和裸露的双链DNA不同,直到力达到90 pN才观察到了过度拉伸导致的变化。这样的现象可能是因为Sytox橙结合双链DNA稳定了结构,使其更加难于融解。当过度拉伸导致变化时产生了蓝色荧光,显示出双链DNA到单链DNA的结构变化。而且又一次观察到DNA的剥离不仅从两侧而且从缺口处开始的现象。
双链DNA开始融解,RPA开始结合单链DNA时,力的大小开始下降,表示包被了RPA的融解DNA已经稳定,不能再次退火形成双链DNA。最后,力的大小降至20 pN,Sytox橙分离,RPA依然保持结合。在理解了小分子配体存在时的DNA的结构变化和如何通过分子水平的机械操纵来研究这些相互作用可以引导生物学和生物物理学产生突破性的发现。
使用C-Trap光镊-荧光技术可以实时观察并检测结构变化。单分子的张力和拉伸的数据对研究生物分子和生物聚合物有重大意义。
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