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LCMSMS法测定动物源食品中硝基呋喃代谢物残留量的前处理分析

weiqing

2018/09/18

液质联用（LCMS）

原理：样品经盐酸水解，用2-硝基苯甲醛过夜衍生，调pH值7.1-7.5后，用乙酸乙酯提取，液相色谱-串联质谱检测，内标法定量。具体分析步骤如下：
1 试样的制备,水解和衍生化
称取2.5g（粉体样品减半，精确至0.01g）制备的样品（鱼虾等取可食部分按标准要求取样），置于50mL塑料具塞离心管中，加入10mL 0.2mol/L盐酸溶液，用匀质机高速匀质1min，再依次加入200µL 10ng/mL 内标标准液, 0.05mol/L的2-硝基苯甲醛衍生剂甲醇溶液400µL，振摇1min，置于37°C，120rpm的恒温摇床中保持16小时。
1.2提取,净化和溶解
将上述衍生溶液取出放置至室温，加入5mL 0.2mol/L磷酸氢二钾溶液，振摇2min。用1mol/L氢氧化钠溶液，0.2mol/L盐酸溶液调节pH约7.1-7.5, (pH计调节，用水清洗电极于离心管中，控制体积不超过20mL)。5000转/min离心10min，取上清液于另一50mL带盖塑料离心管中。加20mL乙酸乙酯, 振摇10分钟, 5000r/min离心5min,吸取上层乙酸乙酯溶液于另一带盖塑料离心管中；残渣中加20mL乙酸乙酯重新提取一次，合并乙酸乙酯层,提取液于 38°C用氮吹仪吹干，加入1.0mL20%甲醇水溶液，涡旋1min，过0.22µm滤膜待进样。
1.3 方法空白
除不加样品外，其余步骤同上。
1.4 标准曲线和QC
1.4.1标准曲线:取5个50mL塑料具塞离心管,分别加入10μL,20μL,40μL,100μL,200μL硝基呋喃代谢物的标准溶液（50ng/mL）,除不加样品外，其余步骤同1.1衍生，1.2项净化及溶解的操作。使最终定容浓度为0.5ng/mL, 1.0ng/mL, 2.0ng/mL, 5.0ng/mL, 10.0ng/mL。内标浓度为2.0ng/mL。
1.4.2 QC点：取1个50mL塑料具塞离心管，加入100μL 20 ng/mL的QC混合标准溶液，内标浓度为2.0ng/mL。除不加样品外，其余步骤同1.1衍生，1.2项净化及溶解的操作。使最终定容浓度为2.0ng/mL。
1.5 加标试验
称取2.5g（粉体样品减半，精确至0.01g）样品，置于50 mL塑料具塞离心管中，加入40μL 50ng/mL标准溶液,其余步骤同1.1衍生，1.2项净化及溶解的操作。使最终定容浓度为2.0ng/mL。
1.6 仪器参数条件可参考GB/T 21311-2007。
1.7 定量计算
结果计算公式为 :
X = c • V / m
式中：
X---试样中被测组分残留量，单位为（µg/kg）；
C---从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，机读数，单位为（µg /L）;
V---样品溶液定容体积，单位为（mL）；
M---试样的质量，单位为（g）；
注：计算结果需要将空白值扣除。
1.8 方法检测限
水产品及肉类基质：呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ): 0.2µg/kg；呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ): 0.2µg/kg；呋喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲(AHD) : 0.2µg/kg；呋喃西林的代谢物氨基脲(SEM):0.5µg/kg。
基质干扰较大的粉类基质,方法检测限为: 呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ): 0.5µg/kg；呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ): 0.5µg/kg；呋喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲(AHD) : 0.5µg/kg；呋喃西林的代谢物氨基脲(SEM):1.0µg/kg。
1.9 质量控制
1.9.1每次试验做一个方法空白,方法空白<0.1ng/mL, 仪器最多间隔20针进1针方法空白.
1.9.2 标准曲线的回归系数大于等于0.995.
1.9.3 QC点的浓度为2.0 ng/mL, 回收率应在80%-120%,仪器最多间隔20针进1针QC.
1.9.4 样品加标试验的回收率在70%-130%。
1.9.5 超过MDL的样品，进行双样定量分析, 相对百分比差值小于20％。
1.9.6 每次实验的同类基质至少做一个平行样.
1.10 注意事项
1.10.1对于含油较多的样品,在净化氮气吹干后,用2mL乙腈溶解,加2mL用乙腈饱和的正己烷去油,弃去上层正己烷,氮气38℃吹干, 加入1.0mL 20%甲醇溶液，涡旋1min，过0.22µm滤膜待进样。
1.10.2 对于动物肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣样品GB/T 21311-2007要求称取样品后加入10 mL 50%甲醇水溶液，振荡10 min后，以4000r/min离心5min，弃去液体，残留物加入10 mL 0.2mol/L盐酸溶液，之后步骤同1.1衍生，1.2项净化及溶解的操作。个人认为若样品测定值为阳性，经此步骤处理后结果会减小甚至变为阴性，建议可参考FDA的方法，省去（加入10 mL 50%甲醇水溶液）水洗步骤，更能客观反映样品真实含量。

温馨提示：夏天大家都喜欢吃小龙虾配冰镇啤酒，经检测发现虾类中硝基呋喃代谢物检出率非常高，希望大家最好不要经常吃，偶尔吃一次还是可以滴！

分
该帖子已被版主-hujiangtao加10积分，加2经验;加分理由:鼓励原创

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zyl3367898

第1楼2018/09/18

应助达人

配个图谱会最好。

0

weiqing

第2楼2018/09/19

应助达人

公司要求数据不能公开，所以就没配图，见谅哈。
zyl3367898(zyl3367898) 发表:配个图谱会最好。

0

m3069787

第3楼2018/09/19

SEM会有本底

1

我是风儿

第4楼2018/09/19

应助达人

你们公司还有这个规定啊

0

weiqing

第5楼2018/09/20

应助达人

嗯，每次都作方法空白，本底基本都很小。
m3069787(m3069787) 发表:SEM会有本底

0

weiqing

第6楼2018/09/20

应助达人

是啊，数据要求保密，所以都没有上图谱。
我是风儿(nphfm2009) 发表:你们公司还有这个规定啊

0

Insm_8abeeb7d

第7楼2018/09/29

我们实验室就对要不要加50%的甲醇水溶液洗有疑问，因为做过比对，用甲醇水洗过和没洗差异很大，我们上次做能力验证就因为这个坑导致所有的结果都有问题，因为新人没有经验，我们找了很多的原因，就是因为国标要求，才洗，洗了结果又不对。

0

symmacros

第8楼2018/10/02

应助达人

前处理的步骤介绍的很详细，好像没看到分析？

0

weiqing

第9楼2018/10/08

应助达人

是啊，洗后结果会小很多。
Insm_8abeeb7d(Insm_8abeeb7d) 发表:我们实验室就对要不要加50%的甲醇水溶液洗有疑问，因为做过比对，用甲醇水洗过和没洗差异很大，我们上次做能力验证就因为这个坑导致所有的结果都有问题，因为新人没有经验，我们找了很多的原因，就是因为国标要求，才洗，洗了结果又不对。

1

weiqing

第10楼2018/10/08

应助达人

我们用的是内标法定量，因为公司有规定，数据和图谱就没发出来，见谅。
symmacros(jimzhu) 发表:前处理的步骤介绍的很详细，好像没看到分析？

0

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