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【前处理】赛场岁月2——畜产品氟喹诺酮残留检测比武小记

栀子花开

2018/10/17
分析者端木精英队

前处理综合讨论

赛场岁月2——畜产品氟喹诺酮残留检测比武小记

虽然是检测比武的小记，但内容绝大多数是前处理的，所以就发在这个版块，特此说明。
1前言
2013年9月25~27日，浙江省第四届农产品质量安全检测技能竞赛暨第二届全国检测技能竞赛浙江省预赛在杭州举行，本人有幸参加了畜产品组比武。
2比赛项目
本次比武的项目是鸡肉中氟喹诺酮残留检测，依据的标准是《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》(农业部1025号公告-14-2008)。比武的主要内容是取已匀浆的鸡肉样品，加标后进行前处理及净化，然后将提取液交赛事工作人员统一上机处理，拿到数据后填写原始记录上交。
3赛前戏言
比武前赛事组织单位提供了几个复习项目(如猪肝中β-激动剂气质检测、猪肉中磺胺总量液相检测、鸡肉中氟喹诺酮类液相检测等)，得知比赛项目后确实很惊讶，因为这个项目只需称取样品、匀浆、离心、上清液过柱净化即可，以至于比赛前我忍不住嘀咕了句：“考这么简单的项目？”当时一位裁判老师听闻后对我说：“小心阴沟里翻船！”事实证明裁判老师的预言不无道理！
4标准相关内容
《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》(农业部1025号公告-14-2008)有关提取和净化的内容如下：
提取：取(2±0.05) g试料，置30 mL匀浆杯中，加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL，10 000 r/min匀浆1 min。匀浆液装入离心管中，中速振荡5 min，离心(肌肉、脂肪10 000 r/min 5min；肝、肾15 000 r/min 10min)，取上清液，待用。用磷酸盐缓冲溶液10.0 mL洗刀头及匀浆杯，转入离心管，洗残渣，混匀，中速振荡5 min，离心(肌肉、脂肪10 000 r/min 5min；肝、肾15 000 r/min 10min)。合并两次上清液，混匀，备用。
净化：固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2 mL预洗。取上清液5.0 mL过柱，用水1 mL淋洗，挤干。用流动相1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱法测定。
5比赛规定处理程序
考虑到比赛进度，以及仪器设备交叉使用等问题，比赛时的处理程序为：
提取：取(2±0.05) g试料，置于50mL塑料离心管中，加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL，10 000 r/min匀浆1 min。取一小烧杯用磷酸盐缓冲溶液10.0 mL洗刀头，备用。离心管中速振荡5 min，10 000 r/min 离心5 min，取上清液。用小烧杯中溶液洗离心管残渣，混匀，中速振荡5 min，10 000 r/min 离心5 min，取上清液。合并两次上清液，混匀，备用。
净化：固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2 mL预洗。取上清液5.0 mL过柱，用水1 mL淋洗，挤干。用流动相1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱法测定。
6操作过程
需要说明的是，比赛所需的样品、试剂均由赛事组织单位提前完成制备，设备均已处于开机状态，选手可以直接使用。
6.1称取样品
要求：称取(2±0.05)g样品，置于50mL塑料离心管中。
操作：(1)检查天平是否处于水平位置，若否应调整至水平位置，并向裁判示意；(2)取一玻璃烧杯作盛放离心管容器，置于天平；(3)取50mL塑料离心管，做好标记（1A、2A）；(4)取1A号离心管置于烧杯中，天平去皮；(5)用药匙先将鸡肉样品充分混匀，刮取适量置于离心管底部；(6)置于天平称量，并检查是否处于要求范围内，若否进行适当调整；(7)依样进行第2份样品操作。
要点：(1)称量前一定要检查天平是否处于水平状态；(2)塑料离心管共取4支，2支用于盛放样品（编号为1A、2A），2支用于离心时平衡（编号为1B、2B）；(3)鸡肉样品从冷冻状态取出后回温，有固液分离现象，取样前需先用药匙将样品搅拌均匀，否则实验结果平行性可能不佳；(4)取样时务必将样品置于离心管底部，不能粘在离心管壁上部。
6.2加标
要求：加入氟喹诺酮类混合标样0.5mL。
操作：(1)取一玻璃烧杯，做好标记；(2)于烧杯内倒入适量混合标样；(3)取一吸管，做好标记；(4)吸取混合标样，对吸管进行润洗操作数次，液体放入废液缸；(5)吸取混合标样，小心放液至刻度0处，向离心管放液0.5mL；(6)依样进行第2份样品操作。
要点：(1)烧杯、吸管宜做好标记，以免忙中出错；(2)吸管一定要进行润洗；(3)观察容量时刻度线要与眼睛齐平；(4)废液一定要放入指定的缸内。
6.3加提取液
要求：加入磷酸盐缓冲液10.0mL。
操作及要点：与6.2相似。
6.4匀浆
要求：10000 r/min匀浆1min。
操作：(1)将匀浆机刀头浸入1A号离心管液面以下，开启匀浆机进行匀浆；(2)匀浆时间控制在1min左右，时间过长对匀浆效果并无明显改善，且产生的高温反而可能导致待检成分分解；(3)匀浆完成后取走离心管，用预先准备的装有磷酸盐缓冲液10.0mL的小烧杯对刀头进行清洗，并用干净的滤纸吸干刀头上的水分。
要点：(1)清洗刀头的烧杯和磷酸盐缓冲液要预先准备好；(2)匀浆速度调整至何位置要预先熟悉；(3)匀浆时要注意随时移动离心管，使匀浆充分均匀；(4)匀浆完成后应及时对刀头进行清洗，以免刀头未洗造成待检成分损失；(5)如刀头内有纤维缠绕应及时取出，并擦干水分，以免影响其他选手操作。
6.5振荡
要求：中速振荡(约160 r/min) 5 min。
操作：(1)将完成匀浆的离心管放入振荡器；(2)开启振荡器进行振荡提取；（3）结束后取出离心管；
要点：(1)离心管一定要旋紧盖子，避免提取液漏出；(2)某些振荡器利用弹簧对离心管进行固定，振荡过程中应不时观察离心管是否脱离夹具。
6.6离心
要求：离心(10 000 r/min 5min)，取上清液。
操作：(1)玻璃烧杯置于天平并去皮置零；(2)分别对离心管（编号为1A、2A）进行称重并记录；(3)分别将离心管（编号为1B、2B）放入烧杯，加水至与离心管（编号为1A、2A）相同质量；(4)将4支离心管按两两对应放入离心机中进行离心；(5)离心结束后小心取出离心管；(6)取一新的50mL离心管，小心将上清转入。
要点：(1)离心前一定要选进行平衡；(2)离心结束后取离心管和转移上清时，一定要轻拿轻放；(3)盛放上清液的离心管编号，应与原离心管编号相同，提前做好标记。
6.7洗残渣、振荡、离心
操作：(1)将小烧杯中的磷酸盐缓冲液10.0mL倒入离心管中，并盖紧离心管盖；(2)离心管置于旋涡振荡器中涡旋1min，使残渣充分分散；(3)振荡及离心参照6.5及6.6；(4)合并两次上清液。
要点：(1)小烧杯中的磷酸盐缓冲液与离心管要一一对应；(2)离心管盖一定要旋紧，否则涡旋时易漏液；(3)涡旋时需要掌握一定的角度与力度，否则效果不佳。
6.8固相柱活化
操作：(1)取固相萃取柱（查标准是C18柱，但我印象中用的是HLB柱），安装在萃取装置上，关闭放液开关；(2)取烧杯，分别倒入少量甲醇、磷酸盐缓冲液、水以及流动相；(3)取吸管，用少量甲醇润洗3次，然后吸取甲醇2mL，加入固相柱，调节放液开关放液；(4)接近放完时，加入磷酸盐缓冲溶液2 mL，放液；(5)接近放完时，用单标线吸管加入上清液5.0 mL，放液；(6)放液完成后，加入水1mL淋洗，并用吸耳球吹干；(7)在装置下面放入接洗脱液的试管，放好装置后用流动相1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液；(8)取1mL注射器去针头，吸取适量洗脱液，接上一次性滤器进行过滤，用进样瓶接取滤液，供上机测定。
要点：(1)安装好固相柱后，一定要记得关闭放液开关；(2)几个烧杯要分别做好标记，以免混用；(3)活化柱子时要避免柱子干掉；(4)用一次性滤器过滤时，压力不宜过大，以免击穿滤膜。
比赛至此，选手的现场操作基本结束。待次日检测数据及谱图出来后，填写原始记录并计算结果，上交赛事组织方即完成全部比赛内容。
7比赛得失谈
7.1失
由于大多数选手是第一次参加此类大赛，很多问题都是预先没有考虑到的，还有一些问题是赛场压力造成发挥失常的，以下仅举几例：
7.1.1吸管不润洗：少数选手拿到吸管，未经润洗直接吸液、放液。直到好几步操作下来后，发现旁边的选手（3个选手同时比赛相距不远）动作明显偏慢，才意识到自己的操作有问题。
7.1.2离心前不平衡：有选手拿着2个平衡样，想直接放入离心机离心。结果被裁判直接叫停并扣分，那个选手还愣愣地不知道怎么回事，经裁判提醒后还以为2个待检样质量相同就不用平衡。
7.1.3涡旋前未旋紧盖子。结果可想而知，回收率肯定不佳。
7.1.4过柱时未充分发挥真空泵作用：活化时各位选手都选择自然放液，速度虽然有快有慢，但差异不显著，都还可以接受。但加入上清液后，绝大多数选手的放液速度都受到很大挑战，液体滴下的速度简直与蜗牛可以一拼。因为净化步骤有时间限制，有的选手就想着用吸耳球加压，结果效果不理想。看着时间只有不足2分钟，裁判老师们也急了，禁不住质问各位选手为何不使用真空泵？真是一语惊醒梦中人，各位选手马上启动真空泵，放液速度怎么还是这么慢？旁边的工作人员提醒各位选手，真空泵上有个真空度调节开关，顺时针旋就可以增加真空度。说得迟那时快，老师的话还没说完，几个选手几乎同时将真空度调节开关调到最大，只看到固相柱中的液体迅速排到下面试管中……
7.2得
7.2.1经历过比赛后，对标准的研读也会更加细致；
7.2.2对操作的各个细节会更加注意，如做好标记、离心前先平衡、盖紧盖子再涡旋等等；
7.2.3对仪器的操作做到提前了解细致，遇到未使用过的新仪器，比赛前要逐一先开机试用，掌握手感，做到比赛时心中有数；
7.2.4最大的得当然还是比赛中拿到名次，比赛结束后半个多月，省农业厅等4部门联合发文，对优秀组织单位和个人予以通报表扬，本人有幸获得畜产品组三等奖。这是第一次参加如此高规格的比赛，说实在话除了以前参加过几次分析培训外，还真的没做过类似的实验，因此能有这个收获对自己来说还是挺有意义的。
实际上这次比赛，最大的失与得，就在于学会了在净化过程中，应该合理利用固相萃取装置的负压，全程随时调节液体排放速度，做到既保持净化效果，又提高净化效率。

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yy_0324

第1楼2018/10/18

畜产品氟喹诺酮残留检测比武小记——内容丰富，详细全面。

0

symmacros

第2楼2018/10/18

应助达人

考的简单，不是，这么多步骤，步步精心，注意事项多。能够获奖，楼主实在厉害。

0

Better521

第3楼2018/10/18

细节决定成败。

0

沧海青城

第4楼2018/10/24

应助达人

很有用的心得体会

0

WUYUWUQIU

第5楼2018/10/25

应助达人

每一步操作都需要用心完成

0

zal

第6楼2018/11/02

应助达人

总结的很好

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xiaolizi0426

第7楼2018/11/19

从11年开始每年我省的技能大比武我都参加，所有项目都考了遍，现在农业厅领导见了我就笑，又来了，哈哈，看了你的总结仿佛又到了比赛现场，具体详细。

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栀子花开

第8楼2018/11/19

应助达人

我们是两三年赛一次，待遇和你差不多，都是可以刷脸的存在，哈哈
xiaolizi0426(xiaolizi0426)发表:从11年开始每年我省的技能大比武我都参加，所有项目都考了遍，现在农业厅领导见了我就笑，又来了，哈哈，看了你的总结仿佛又到了比赛现场，具体详细。

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疲惫的行人

第9楼2019/11/12

请问怎样能参加？？？
xiaolizi0426(xiaolizi0426) 发表:从11年开始每年我省的技能大比武我都参加，所有项目都考了遍，现在农业厅领导见了我就笑，又来了，哈哈，看了你的总结仿佛又到了比赛现场，具体详细。

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栀子花开

第10楼2019/11/18

应助达人

一般每年下半年省里会举行初赛，市里会提前半个月至一个月举行选拨赛，有的市可能不选拨直接组队参加省里的初赛

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