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【分享】凝胶层析的知识(基本原理,凝胶类型与选择,凝胶的处理)

前处理综合讨论

  • 基本原理

    凝膠過濾法(gel filtration)也稱為排阻層析(exclusion chromatography)、凝膠層析(gel chromatography)或分子篩層析(molecular sieve chromatofraphy),它是在1960年後發展出來的技術。

    凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質,內部具有網狀篩孔,利用球狀凝膠內的篩孔,使分子流過填充凝膠的管柱時,大分子無法進入凝膠篩孔,而只流經凝膠及管柱間的孔隙,很快就可以流出管柱,較小的分子因為進入凝膠內的篩孔,故在管柱內的停留時間較長,由此區分大小不同的分子,亦可與已知大小的分子作比較而定出一分子的分子量。一般狀況下,凝膠不會吸附成份,所有欲分離物質都會被洗出,這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。

    目前常用的凝膠包括3個主要類型:

    1. Polydextran
    Polydextran的商品名稱是Sephadex,它幾乎不溶於溶劑中,親水性強,能迅速在水和電解質溶液中膨脹,在鹼性的環境中十分穩定,所以可以用鹼去除凝膠上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型號,如 G-25、G-75、G-100或是G-200,G 後面的數字為凝膠吸水量再乘以10,以G-25為例,表示1克乾燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml 。

    2. Polyacrylamide
    Polyacrylamide是一種合成凝膠,商品名Bio-Gel P,乾粉顆粒狀,在溶劑中自動溶成膠體,依膠的分離範圍不同,分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300,P後面的數字乘以1000為最大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑,但它在極端的pH 下會被水解,水解後產生的COOH-具有離子交換的性質,因此pH 值應盡量控制在2-10之間。

    3. Agarose
    商品名Separose,屬於天然凝膠,依凝膠中乾膠的百分含量,分為Sepharose 2B,4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠,主要用於像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質,因其顆粒軟,在分離過程有時會阻塞管柱,造成流速減慢,又因其在攝氏50度以上會融化,故需於較低溫的環境中進行層析。Agarose 做成beads後不能再脫水乾燥,所以要在溼態中保存。


    凝膠和管柱的選擇

    凝膠的材質需為化學惰性,與分離物不能產生變性(denature)或是其它化學反應,最好具有能長期反覆使用的穩定性,並可以在較大的pH和溫度範圍內使用。由於凝膠上的離子交換基團會吸附帶電荷的物質,產生離子交換的效果,所以凝膠上最好不具有離子交換的基團。此外,凝膠要有一定的機械強度,在層析過程中才不會變形,增加機械強度也可使層析在較高壓力的環境進行,縮短分離時間。

    凝膠顆粒的粗細與分離效果有直接關係,顆粒細的分離效果好,但流速慢而費時,因此要依據實際的需要來選擇。對於分子量較小的物質,一般採用polydextran或polyacrylamide材質的凝膠,大分子物質則使用agarose。

    以Sephadex為例,Sephadex G-50可用於區分分子量1,500~30,000之分子,而Sephadex G-75 凝膠可區分分子量3,000~70,000之分子,所以若要分離分子量10,000及20,000之分子,兩種都適用。

    如果要分離的分子大小相差很多,則可選用柱高:直徑=5:1~15:1的管柱,且管柱體積要大於4~15倍的樣品體積;如果要分離的物質之間分子量差異不大,則要選用柱高:直徑=20:1~100:1的管柱,且管柱體積要大於25~100倍的樣品體積。

    凝膠的處理

    商品凝膠一般是乾燥的顆粒,使用前要先泡在欲使用的沖洗液中,使它充份膨脹,否則有引起凝膠柱破裂的危險。熱脹法是常用的前處理法,即把浸於沖洗液中的凝膠加熱,讓它膨脹並除去氣泡,溫度夠高的話(加溫至近沸騰)也可消毒殺菌。凝膠處理過程不能劇烈攪拌,如此易使顆粒破裂,影響流速。

    將凝膠裝入管柱的方法有很多種,實驗室常用的方法是先在柱中加入約1/3 體積的沖洗液,邊輕輕攪伴邊將凝膠懸浮液倒入其中,等到底部沉積約1~2公分的凝膠後,打開下方出口讓水流出,上面不斷加入懸浮液,等到沉積到離頂部約3~5公分處停止,讓3~5倍柱床體積的緩衝液流過層析柱。若用polydextran的凝膠,可放入有顏色的蛋白質(如cytochrome c)流過管柱,看看色帶是否均勻下降,不均勻或出現氣泡,凝膠均需倒出重新填裝。

    衝洗緩衝液僅需留高於柱床2 公分左右,多餘的可用滴管吸去,再將出口打開使衝洗液流到距表面1~2公釐,關閉出口,用滴管緩緩加入樣品再打開出口,樣品完全滲入凝膠內後,加入約4公分衝洗液,出口處接上收集瓶開始層析。

    由於polydextran 和agarose都屬於多醣類,一旦微生物生長過多,分泌的酶會水解凝膠使其性質改變,為了防止這種情況發生,凝膠最好採用真空或低溫保存,但溫度不能過低使凝膠凍結。加入抑菌劑(chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等)也是常用的方法。長時間不用的凝膠可用乾燥保存法,也就是把使用過的凝膠用水除去碎顆粒和雜質,再用不同濃度的酒精,由70%、90%到95%逐步脫水,在攝氏60~80度下烘乾,不能加熱的Sepharose則用乙醚洗滌乾燥。
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    第3楼2007/01/11

    换成简体字:


    基本原理
    凝胶过滤法(gel filtration)也称为排阻层析(exclusion chromatography)、凝胶层析(gel chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatofraphy),它是在1960年后发展出来的技术。

    凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,內部具有网状筛孔,利用球状凝胶內的筛孔,使分子流过填充凝胶的管柱时,大分子无法进入凝胶筛孔,而只流经凝胶及管柱间的孔隙,很快就可以流出管柱,较小的分子因为进入凝胶內的筛孔,故在管柱內的停留时间较长,由此区分大小不同的分子,亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状況下,凝胶不会吸附成份,所有欲分离物质都会被洗出,这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

    目前常用的凝胶包括3个主要类型:
    1. Polydextran
    Polydextran的商品名称是Sephadex,它几乎不溶于溶剂中,亲水性强,能迅速在水和电解质溶液中膨胀,在碱性的环境中十分稳定,所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号,如 G-25、G-75、G-100或是G-200,G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10,以G-25为例,表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml 。
    2. Polyacrylamide
    Polyacrylamide是一种合成凝胶,商品名Bio-Gel P,干粉颗粒状,在溶剂中自动溶成胶体,依胶的分离范围不同,分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300,P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼,但它在极端的pH 下会被水解,水解后产生的COOH-具有离子交换的性质,因此pH 值应尽量控制在2-10之间。
    3. Agarose
    商品名Separose,属于天然凝胶,依凝胶中干胶的百分含量,分为Sepharose 2B,4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶,主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质,因其颗粒软,在分离过程有时会阻塞管柱,造成流速减慢,又因其在摄氏50度以上会融化,故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥,所以要在湿态中保存。

    凝胶和管柱的选择
    凝胶的材质需为化学惰性,与分离物不能产生变性(denature)或是其它化学反应,最好具有能长期反复使用的稳定性,并可以在较大的pH和温度范围內使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质,产生离子交换的效果,所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外,凝胶要有一定的机械强度,在层析过程中才不会变形,增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行,缩短分离时间。

    凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系,颗粒细的分离效果好,但流速慢而费时,因此要依具实际的需要来选择。对于分子量较小的物质,一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶,大分子物质则使用agarose。
    以Sephadex为例,Sephadex G-50可用于区分分子量1,500~30,000之分子,而Sephadex G-75 凝胶可区分分子量3,000~70,000之分子,所以若要分离分子量10,000及20,000之分子,两种都适用。

    如果要分离的分子大小相差很多,则可选用柱高:直径=5∶1~15∶1的管柱,且管柱体积要大于4~15倍的样品体积;如果要分离的物质之间分子量差异不大,则要选用柱高:直径=20∶1~100∶1的管柱,且管柱体积要大于25~100倍的样品体积。

    凝胶的处理
    商品凝胶一般是干燥的颗粒,使用前要先泡在欲使用的沖洗液中,使它充份膨胀,否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法,即把浸于沖洗液中的凝胶加热,让它膨胀并除去气泡,温度够高的话(加温至近沸腾)也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能剧烈搅拌,如此易使颗粒破裂,影响流速。

    将凝胶裝入管柱的方法有很多种,实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的沖洗液,边轻轻搅拌边将凝胶悬浮液倒入其中,等到底部沉积约1~2公分的凝胶后,打开下方出口让水流出,上面不断加入悬浮液,等到沉积到离顶部约3~5公分处停止,让3~5倍柱床体积的缓冲液流过层析柱。若用polydextran的凝胶,可放入有颜色的蛋白质(如cytochrome c)流过管柱,看看色带是否均匀下降,不均匀或出现气泡,凝胶均需倒出重新填裝。

    冲洗缓冲液仅需留高于柱床2公分左右,多余的可用滴管吸去,再将出口打开使冲洗液流到距表面1~2公分,关闭出口,用滴管缓缓加入样品再打开出口,样品完全渗入凝胶內后,加入约4公分冲洗液,出口处接上收集瓶开始层析。

    由于polydextran 和agarose都属于多糖类,一旦微生物生长过多,分泌的酶会水解凝胶使其性质改变,为了防止这种情況发生,凝胶最好采用真空或低温保存,但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂(chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等)也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法,也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质,再用不同浓度的酒精,由70%、90%到95%逐步脱水,在摄氏60~80度下烘干,不能加热的Sepharose则用乙醚洗涤干燥。

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