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Kromasil技术支持Q&A---第二弹！！！

吕梁山

2019/01/25

4.如何监测色谱柱的性能变化？
建议按照产品包装盒内附带的方法测试柱效。注意保持测试条件一致，进样量不超过下表所示数值：

为达到标准水平的塔板数，减少柱外体积非常重要。如在进样器和色谱柱之间，以及色谱柱和检测器之间正确设置管路连接。
5. 如何清洗和再生色谱柱？
柱压升高、保留时间改变、柱效下降，这些现象都在提示柱床内或者固定相表面有吸附物存在。一般来说按照正确的清洗步骤即可解决问题。需要注意的是，大多数情况下越早清洗（再生）效果越好。
强吸附性物质经常会集中在柱头，许多情况下反向冲洗有利于色谱柱清洗。值得指出的是，装填效果好的色谱柱不会因为逆流操作而降低性能。

反相（疏水固定相）
色谱柱内的沉积物通常以表面吸附或沉淀的形式存在。
【注1】若冲洗效果依旧不佳，可以使用乙醇/1%乙酸水溶液=50/50，以不超过10倍柱体积进行冲洗
再生操作步骤：
1) 针对杂质选择合适的溶剂和比例。在不确定杂质成分的情况下，可以将其作为强极性物质/离子化合物来处理。
2) 降低流速（正常流速的10%），选择反相模式并小幅度升高柱温（<40℃），冲洗量上限为10倍柱体积。
3) 柱压异常时，选择在常用流速下检查柱压变化。
4) 若无好转，则使用适用于带正电荷极性物质以及大分子吸附物的冲洗条件。如果使用十二烷基磺酸钠溶液作为冲洗液，事后需用纯四氢呋喃，二甲基甲酰胺或者乙腈对色谱柱做彻底冲洗。
5) 如果问题依然存在，请联系Kromasil技术支持团队。
正相（极性固定相）
极性固定相，特别是裸硅胶填料，极性物质的强吸附现象是非常常见的。在正相条件下，强极性杂质不能被洗脱下来，但可以使用高比例质子溶剂，视情况也可以加一定量的酸进行冲洗。
如果样品保留时间出现前后不一致，首先检查固定相-水的平衡状态。使用纯疏水溶剂作为流动相会逐渐使固定相“干化”，从而导致保留时间改变，这对于纯硅胶填料尤其如此。
再生操作步骤
1) 使用中等极性有机溶剂，例如四氢呋喃，来平衡色谱柱
2) 在低流速（正常流速的1/10）下使用醇类（甲醇）进行冲洗，并适当添加酸性组分（1-5%乙酸或者甲酸），冲洗量不超过10倍柱体积。
3) 如果问题依然存在，则使用醇水混合物并适量添加酸性组分（盐酸、乙酸等），参照步骤2进行操作。
4) 若冲洗效果不佳，按如下顺序依次冲洗色谱柱：0.5-1.5%氨水；0.5-1.5%酸性水溶液（盐酸、乙酸）；纯水；醇类；四氢呋喃；流动相。
5) 若冲洗效果仍旧不佳，请联系Kromasil技术支持团队。
选择极性较强的溶剂作为流动相，特别对于裸硅胶填料来说，清洗过后需要较长时间来稳定色谱系统的工作状态，这是由于硅胶基质-水的平衡状态被打破。
6. 如何配置具有缓冲能力的流动相？
含有缓冲成分的流动相有以下两种配置方法：
1) 在与有机相混合前完成包括pH调节在内的所有配置过程。
2) 在缓冲溶液和有机相混合之后调节溶液pH值。
在水溶液体系中pH是一个很容易确定的参数，但是在含有机相的体系中，pH值或质子浓度就不容易准确测量。
因此建议在配制缓冲溶液的同时调节pH值，之后使用0.4微米滤膜过滤后再同有机相混合。需注意以下几点：
· pKa值两侧±1范围内是最有效的缓冲区域，以此为参考选择正确的缓冲系统。
· 如需将高浓度缓冲溶液同有机相混合，请考虑缓冲盐析出的可能性。
· 使用0.4微米滤膜对缓冲溶液进行预先过滤。
· 注意纯水相缓冲溶液中细菌和真菌的滋生。
加入有机相后，溶液pH值通常会发生变化，无机缓冲体系（例如磷酸盐）的pH值会有所上升，而有机缓冲体系（例如乙酸）pH值则会有所下降。
举例：pH值7.6的磷酸缓冲液内加入40%甲醇后pH值上升至8.5

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p3291692

第1楼2019/01/29

有很多经验性的东西，值得收藏，我觉得尤其是酸度控制这方面讲的好，有的细节很难把握！

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