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4cl酶反应体系使用液相检测的一些问题

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2019/06/24

液相色谱（LC）

最近在做4cl家族基因的重组蛋白和五种底物酚酸反应的实验，反应体系中存在0.6mM CoA、5mM ATP、6mM MgCl2、0.2M Tris-Hcl、0.2mM 酚酸底物以及浓度不明的重组蛋白。配制了7种不同PH的Tris-Hcl缓冲液（PH=4、5、6、7.1、7.5、8.1、8.9），体系反应10分钟后，沸水煮沸10分钟失活，现使用对香豆酸和酶反应，反应后经12000RAM离心2min后用0.22um过滤头过滤，进样10ul，使用的是XDB-C18的柱子，waters2695的色谱仪，流动相为A1%乙酸和B纯乙腈，洗脱梯度0~5min A：B=95:5,5-35min A：B=25：75，36-5,5min A:B=95:5，56-65min A：B=5:95 进样后发现，除了PH=7.1的样品外其他的样品都没有底物（对-香豆酸）峰，并且所有样品都没有产物（对-香豆酸辅酶A）峰，能请教一下各位大神，怎么解决这个问题
另外还有一个问题，五种酚酸跑混标的时候，芥子酸和阿魏酸总是分不开，大神有没有什么好的方法将他们分开（尽量不使用缓冲盐体系作为流动相），多谢各位了

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夏天的雪

第1楼2019/06/25

应助达人

没有做过该实验，貌似有点复杂，没有出峰，是否是衍生没有成功

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