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食品微生物志贺氏菌方法验证

低调的浮夸

2019/07/27
饮水思源

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食品毒素/微生物检测

食品微生物志贺氏菌方法验证

近期在做食品中志贺氏菌的方法验证，与大家分享一下试验过程及结果。

1、目的：本实验是通过从人员能力、仪器设备、标准菌株及试剂、方法、环境五个方面对食品微生物志贺氏菌检验进行验证。
2、人员能力验证情况
目前实验室人员经培训、考核，具备测定食品微生物学检验志贺氏菌测定的能力，人员能力验证合格。
3、仪器设备验证情况
3.1方法对测试设备的要求
恒温培养箱：36℃±1℃、41.5℃±1℃
3.2目前配备的设备情况：生化培养箱上海龙跃LBI-150：36℃±1℃，生化培养箱上海龙跃LBI-150：41.5℃±1℃；设备经过校准并确认合格。
4、标准菌株及试剂验证情况
4.1方法对标准菌株、试剂的要求
标准菌株：福氏志贺氏菌 ATCC12022
培养基：志贺氏菌增菌肉汤、XLD培养基、麦康凯琼脂(MAC)、志贺氏菌显色培养基、三糖铁(TSI)琼脂、志贺氏菌干制生化鉴定试剂盒、志贺氏菌属四种多价诊断血清、福氏志贺氏菌TR-204、鲍氏诊断血清TR-205
试剂：0.85%灭菌生理盐水
4.2配备情况
福氏志贺氏菌 ATCC12022：美国菌种保藏中心，有效期至2020.8.31
志贺氏菌增菌肉汤：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号20180919
麦康凯琼脂(MAC)：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号20181227
XLD培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号20190305
三糖铁(TSI)琼脂：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号20180828
志贺氏菌显色培养基：北京陆桥生物技术有限公司，批号180518
志贺氏菌干制生化鉴定试剂盒：北京陆桥生物技术有限公司，批号190122
志贺氏菌属四种多价诊断血清：宁波天润生物药业有限公司，批号190101
福氏志贺氏菌TR-204：宁波天润生物药业有限公司，批号20190101
鲍氏诊断血清TR-205：宁波天润生物药业有限公司，批号20180101
无菌生理盐水（氯化钠）：AR 国药集团化学试剂有限公司，批号20181120
4.3验收情况：已验收合格
5、检测方法
食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌GB 4789.5-2012，适用于食品中志贺氏菌的检验；方法现行有效，已受控。
6、环境条件验证情况
6.1方法对测试环境的要求
在环境温度为18℃~26℃，环境湿度为30%~70%，试验区域为百级洁净度进行。
6.2目前对环境的设施和监控情况
环境控制设备：空调环境监控设备：温湿度表，已检定合格，在有效期内
6.3环境验证情况
定期进行沉降菌监测，验证洁净度，合格。
7、方法验证情况
7.1验证方式：向样品中加入标准菌株。
7.1.1合格标准：供试品+目标菌组生长良好。
7.1.2样品：香肠

7.2验证内容
7.2.1菌液制备：取福氏志贺氏菌 ATCC12022的工作菌斜面，用5mL生理盐水洗脱；将上述洗脱液用0.85%生理盐水稀释至菌浓度约为10~100CFU/mL的菌悬液备用。
7.2.2培养基制备：按 GB 4789.5-2012 要求配制。
7.2.3样品前处理：按 GB 4789.5-2016、GB /T4789.17-2003
7.2.4供试品+目标菌组
7.2.4.1增菌：以无菌操作称取25g样品，放入盛有225mL的生理盐水无菌均质袋内；向此均质袋中加入每毫升含菌量约为10~100CFU/mL的福氏志贺氏菌 ATCC12022菌悬液1mL，混匀后作为试验组。于41.5℃±1 ℃，厌氧培养16h~20h。

7.2.4.2分离：取增菌后的志贺氏菌增菌液分别划线于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见下表。

选择性琼脂平板	志贺氏菌的菌落特征
MAC琼脂	无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐
XLD琼脂	粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐
志贺氏菌显色培养基	表面白色，周围紫红色菌落（在陆桥志贺氏菌显色培养基）

7.2.4.4生化试验：将6.2.4.2中选择性平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁和营养琼脂斜面、半固体各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸、不产气、不产硫化氢的菌株，进行生化试验和血清学试验。将可疑菌落制成0.5麦氏浊度的菌悬液分别接种生化试剂盒内，每孔接种0.2mL,置于36℃±1℃培养18h~24h。

7.2.4.5血清鉴定：多价O菌体抗原，挑取菌胎于载玻片上两个区域，其中一个区域加生理盐水，一个区域滴多价O血清，将菌胎研磨成乳状。将玻片摇动混合1min，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，凝集反应为阳性。判定检出志贺氏菌/25g样品中。

7.2.4.4同时做样品空白，样品均无菌生长。

7.2.5以上试验验证结果如下：

样品信息	检测结果/25g
香肠+福氏志贺氏菌	检出
香肠	未检出

7.3验证结果：供试品+目标菌组生长良好。
8、试验结论：本实验室在人员能力、仪器设备、标准物质、试剂、检验方法、环境条件等方面均具备了测定食品微生物志贺氏菌的能力；方法验证方面，综上所述本实验室通过样品加标与样品空白检验均达到食品微生物学检验志贺氏菌GB 4789.5-2012 的要求，综合考虑，本实验室可以开展此项目。