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想利用HPLC测定植物根部脱落酸含量，目前没有一个准确的前处理步骤，我是想利用waters的固相萃取小柱进行前处理。下面是我初步的步骤，哪个大神给指导下，看看哪里不对或者需要注意什么？

dlleap

2019/08/05

液相色谱（LC）

想利用HPLC测定植物根部脱落酸含量，目前没有一个准确的前处理步骤，我是想利用waters的固相萃取小柱进行前处理。下面是我初步的步骤，哪个大神给指导下，看看哪里不对或者需要注意什么？
1.想利用HPLC测定植物根部脱落酸含量，目前没有一个准确的前处理步骤，我是想利用waters的固相萃取小柱进行前处理。下面是我初步的步骤，哪个大神给指导下，看看哪里不对或者需要注意什么？
SPE C18固相萃取小柱 6ml 500mg
1.活化
6ml色谱甲醇过柱，3-5ml/min。
2.平衡
6ml去离子水过柱，3-5ml/min，当水液面要比填料上表面高1mm左右，再上样。
3.上样
取上图第四步离心后的上清液过C18小柱，滴速为宜。过柱前上清液要利用1%乙酸调节pH至2.5-3.0之间。
4.淋洗
50%甲醇溶液，6ml淋洗过柱，去除杂质。抽干
5.洗脱
用2-4倍柱床体积的流动相洗脱。
2.下面是我的HPLC的步骤不知道对不对，希望有人做过类似的可以给指导下，万谢。
1g冷冻根样
↓
液氮研磨成粉末，加入8ml 80%甲醇，4℃浸提过夜,注意避光第一步
↓
离心（10000rpm，4℃ 15min）→→→→→→→→→→→残渣
↓ ↓
↓ 甲醇悬浮，离心（10000rpm，4℃ 15min）第二，三步
↓　合并　 ↓
上清液←←←←←←←←←←←←←←←←←←←←← 上清液
↓
加PVPP0.3g（吸附色素，除去酚类物质，有机酸等）第四步
离心（10000rpm，4℃ 15min）
↓
上清液过C18柱第五步
↓
甲醇液
↓
N2吹干，加入1ml pH为3.0缓冲液溶解（此时，脱落酸成分子状态。可利用1%磷酸调节PBS的pH至3.0）
用乙酸乙酯等体积萃取3次（分液漏斗）第六步
↓
取乙酸乙酯相（上层）N2吹干
1ml 初始流动相复溶（色谱甲醇：水=35：65（v/v）利用1%乙酸调节pH为3.0）第七步
↓
0.45μm有机系微孔滤膜过滤第八步
↓　　　　　　
HPLC测定样品
↓
测ABA

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