如何使用固相微萃取（SPME）做样品分析？

固相萃取 是目前最好的试样前处理方法之一，具有简单、费用少、易于自动化等一系列优点。而固相微萃取是在固相萃取基础上发展起来的，保留了其所有的优点，摒弃了其需要柱填充物和使用溶剂进行解吸的弊病，它只要一支类似进样器的固相微萃取装置即可完成全部前处理和进样工作。该装置针头内有一伸缩杆，上连有一根熔融石英纤维，其表面涂有色谱固定相，一般情况下熔融石英纤维隐藏于针头内，需要时可推动进样器推杆使石英纤维从针头内伸出。
分析时先将试样放入带隔膜塞的固相微萃取专用容器中，如需要同时加入无机盐、衍生剂或对pH值进行调节，还可加热或磁力转子搅拌。固相微萃取分为两步，第一步是萃取，将针头插入试样容器中，推出石英纤维对试样中的分析组分进行萃取;第二步是在进样过程中将针头插入色谱进样器，推出石英纤维中完成解吸、色谱分析等步骤。固相微萃取的萃取方式有两种：一种是石英纤维直接插入试样中进行萃取，适用于气体与液体中的分析组分;另一种是顶空萃取，适用于所有基质的试样中挥发性、半挥发性分析组分。
由于以上优点，SPME迅速在药品和生物样品分析、环境监测与分析，食品检测 等方面有了一席之地，随着各种联用技术和新型涂层材料的发展和成熟，SPME已不在限于以上所说的几个方面，在医药、生物制药(如脂肪酸的分离测定，生物聚合物如蛋白质的吸附萃取)有了更大的发展，SPME已经成为分析方法中重要的一个领域。
1.原理
固相微萃取装置非常小巧，状似一只色谱注射器，由手柄和萃取头或纤维头两部分组成，萃取头是一根外套不锈钢细管的1厘米长、涂有不同固定相的熔融石英纤维头，纤维头在不锈钢管内可自由伸缩，用于萃取、吸附样品，手柄用于安装或固定萃取头，可永久使用。
SPME的理论发展大致分为两个，一是早期的平衡理论，一是近年发展起来的非平衡理论。
平衡理论认为在吸附或吸收的过程中，固-气或固-液相间建立了吸附或吸收平衡，吸附的量为：
n=(KVCV')/(KV+V')　　　　　　(1-1)
其中n为分析物吸附在固相涂层上的量，K为分析物在固相(或气相)和液相之间的平衡常数，V为固相涂层的体积，C为分析物在试样溶液中最初的浓度。从公式中可以看出，n是一个与平衡常数、固相涂层的体积、试样体积及分析物在试样溶液中最初的浓度有关的量。在SPME中选用的固相涂层对于萃取的有机成分有较强的亲和力，一个大的K可以保证有效的富集，提高了分析的灵敏度。通常K值并不足以大到使分析物都被萃取到固相涂层中，因此SPME仅仅是一种平衡取样的方法。若试样体积不变，在整个浓度区间，n与c呈指数而非线性的关系。仅当c较低时，即平衡处于吸附等温线的线性范围内，公式(1)才成立。若试样溶液有一个足够低的浓度(50微克每升以下)，为了使响应值(n)与c保持线性关系，试样体积也受到限制(如小于5毫升)，否则线性响应关系就不在保持。
非平衡理论侧认为在一定时间内，由于慢传质过程，平衡未完全达到。考虑到分析物在两相中的扩散过程，它被萃取到固相涂层的量为：
n=C﴾1-exp(-A(2mm'KV+2mm'V')/mVV'+2m'KVV')﴿(KVV'/KV+V') (1-2)
式中K为分析物在试样介质和涂层之间的平衡常数，A为涂层的表面积，m、m'分别为分析物在试样和在固相涂层中的质量转移系数(m为扩散系数除以涂层厚度)。在SPME采样时，并不一定要求分析物完全被萃取或一直进行到平衡建立，只要在严格条件下获得可靠且稳定的响应值与浓度之间的线性关系。当吸附(吸收)时间无限长时，则达到平衡后分析物在固相涂层中的量n'为：
n'=KVV'/KV+V'(1-3)
此结果和平衡理论是一样的。
2　固相微萃取技术条件的选择
2.1　萃取效果影响的因素
2.1.1　萃取头的选择
萃取头是SPME装置的核心，其涂层的性质已经成为SPME方法成功与否的关键。因此对其选择要十分慎重。涂层的选择应该由待测物质的性质决定，一般根据相似相溶原理进行选择，极性大的待测物质选择强极性的涂层，极性小的选择弱极性的涂层材料。小分子 或挥发性物质常用厚膜100微米萃取头，较大分子或半挥发性物质采用7微米萃取头，综合考虑分析物的极性和挥发性时，还可以有85微米、65微米、75微米、30微米的极性或非极性萃取头选择。固定相层可以以非键合、键合或部分交联的形式涂敷在石英纤维上，涂层在有机溶剂中的稳定性为：键合相>部分交联>非键合相，非键合相在有机溶剂中还有较大的溶胀性。最常用的固相涂层物质是聚甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酸酯(PA)，前者用于非极性化合物、多环芳烃、芳香烃等， 100微米的PDMS适用于分析低沸点的极性物质，7微米的PDMS适用于分析中沸点和高沸点的物质。后者多用于极性化合物如苯酚类化合物。
随着SPME的不断发展，新型的涂层材料也不断出现：涂有石墨碳黑的石英纤维用于分析水中和空气中的微量化合物，特点是表面多孔、热稳定性好、不保留水、吸附容量大等;Liu等人将键合有碳八和碳十八液相色谱用硅胶用高温环氧固定在金属丝上，将其用于分析水中的芳香烃化合物和多环芳烃，此涂层表面积大、易于达到吸附平衡、可提高检测灵敏度;公认的性能较好的极性涂层材料Omegamax250在人体血清样、尿样的分析中效果良好，且干扰峰很少，而用此涂层对研碎药片中的雷尼替丁(ranitidine)进行分析，可得到较低的检测限(0.1微克每升)，而多孔二乙烯基苯聚合物类涂层材料可用于杂环胺类的诱导变性剂、安非他明等药物的检测，检出限均在1微克每升以上;而Athur、Michalska等人提出以导电聚合物吡咯(PPY)作为涂层材料，得到了许多人的赞同，导电聚合物易于在单体上引入功能基或在其上沉积金属离子和存在多重作用力如π-π作用、偶极作用、酸碱作用等，PPY能在空气中与有机溶剂保持相对稳定，且其单体和衍生物易得，Wu等人以其作为涂层材料成功地对β-受体阻断剂等物质进行分析，证明PPY有较高的萃取效率，PPY也可用于药物如安非他明的检测，甚至是离子型的待测物它也可以进行检测;此外，还有人开发了纤维双液相涂层，它克服了单液相涂层萃取有机化合物范围狭窄的缺点。
涂层材料必须满足对待测物有较强萃取能力外，还应在常用的有机溶剂中保持足够的稳定性，实际上的涂层很难两个方面都满足，如PA在使用了10-20次后就因损伤而不能再继续使用，这使得SPME方法的重现性受到一定的制约。涂层材料越厚，对待测物吸附量越大，可降低最低检出限，但同时也会增加平衡萃取时间，减慢分析速度，而非键合相在溶剂中有一定的溶胀性对涂层厚度也应当考虑。
2.1.2　试样量、容器体积
由于固相微萃取是一个固定的萃取过程，为保证萃取的效果需要对试样量，试样容器的体积进行选择。试样量与试样容器的体积对于保证结果有很大关系，试样量与试样容器体积之间存在有匹配关系，试样量增大的情况下，重现性明显变好，检出量提高。
2.1.3　萃取时间
萃取时间是从石英纤维与试样接触到吸附平衡所需要的时间。为保证试验结果重现性良好，应在试验中保持萃取时间一定。影响萃取时间的因素很多，例如分配系数、试样的扩散速度、试样量、容器体积、试样本身基质、温度等。在萃取初始阶段，分析组分很容易且很快富集到石英纤维固定相中，随着时间的延长，富集的速度越来越慢，接近平衡状态时即使时间延长对富集也没有意义了，因此在摸索实验方法时必须做富集—时间曲线，从曲线上找出最佳萃取时间点，即曲线接近平缓的最短时间。一般萃取时间在5～60 min以内，但也有特殊情况。
2.1.4　使用无机盐
向液体试样中加入少量氯化钠、硫酸钠等无机盐可增强离子强度，降低极性有机物在水中的溶解度即起到盐析作用，使石英纤维固定相能吸附更多的分析组分。一般情况下可有效提高萃取效率，但并不一定适用于任何组分。
2.1.5　改变pH值
改变pH值同使用无机盐一样能改变分析组分与试样介质、固定相之间的分配系数，对于改善试样中分析成分的吸附是有益的。由于固定相属于非离子型聚合物，故对于吸附中性形式的分析物更有效。调节液体试样的pH值可防止分析组分离子化，提高被固定相吸附的能力。
2.1.6　衍生化
衍生化反应可用于减小酚、脂肪酸等极性化合物的极性，提高挥发性，增强被固定相吸附的能力。在固相微萃取中，或向试样中直接加入衍生剂，或将衍生剂先附着在石英纤维固定相涂层上，使衍生化反应得以发生。
2.2　萃取速度影响因素的选择
2.2.1　加热
加热试样可以加速试样分子 运动的速度，尤其能使固体试样的分析组分尽快从试样中释放出来，增加蒸汽压，提高灵敏度，对于顶空分析尤为重要。但过高的温度会降低石英纤维固定相对组分的吸附能力。选择一个合适的温度非常重要。
2.2.2　磁力转子搅拌、高速匀桨、超声波
磁力转子搅拌可促使试样均匀，尽快达到平衡，在很多试验中发现能明显提高萃取效率，且转速越高，达到平衡的速度也越快。使用高匀桨的出发点与磁力转子搅拌是一致的，但高速匀桨的速度远远高于磁力转子搅拌，其效果更好，仅用磁力转子搅拌萃取时间的1/3。使用超声头对试样进行超声更有助于分析组分的吸附，在三者中效果最好，同磁力转子搅拌相比缩短时间90%。由于磁力转子搅拌同高速匀桨、超声波相比所用设备最简单，所以基本上仍使用磁力转子搅拌法。但搅拌法对于某些试样并不适合，需要针对具体试样进行试验。
上述所有条件对于改善试样中分析组分的萃取是有作用的，但必须要结合起来才能发挥最大效应。在设计实验方案时需要综合考虑以上各种因素，筛选出最优化法。
2.3　固定相的处理
固相微萃取中的关键部位是石英纤维固定相，靠它对分析组分吸附和解吸，如果曾用过而上面的组分未被解吸掉，则会对以后的分析结果有干扰。每次使用前必须将其插入气相色谱 进样器，在250℃左右置1h，以去除上面吸附的干扰物,如果曾分析过衍生化组分则需要放置更长时间。
3.联用技术
SPME可以与气相色谱仪GC、液相色谱仪LC等分离技术联用进行分离。还可与ICP-MS、红外光谱IR、微波辅助萃取(MAE)-GC、电解分析等联用。
3.1 SPME与GC
SPME与GC是最早研究也是目前发展最为成熟的技术。SPME装置可在GC的进样口直接进样，不存在接口问题。在与GC联用的情况下，SPME装置貌似一支微量注射器，萃取头是在一根石英纤维上涂上固相萃取涂层，外套细不锈钢管以保护石英纤维不被折断，纤维头可在钢管中伸缩。将纤维头浸在样品液或顶空气体中一段时间，同时搅拌溶液以加速两相间达到平衡的速度，待平衡后将纤维头直接插入色谱仪进样口，被吸附(吸收)在石英纤维固定相上的分析物在气化室200～300℃下热脱附。然而对于一些分子量很大的化合物，热脱附很难，Conte等人提出了用金属丝代替石英纤维的装置，用在金属丝两端通电的方法，解决了这一问题。
3.2 SPME与HPLC
SPME与GC联用不适合与热不稳定化合物及表面活性剂、药物、蛋白质等半挥发和不挥发组分的分析，而SPME与HPLC联用可以解决其局限性，扩大SPME的应用范围。
随着SPME技术的发展，SPME-HPLC联用成为了发展的重要方向之一。与SPME-GC不同，它需要一个接口。因为萃取过程虽与SPME-GC相似，但脱附过程却与在GC中的脱附完全不同，即使用溶剂脱附而非热脱附。因此，如何用最少量的溶剂完全洗脱待分析物，即避免样品体积过大带来的显著的柱外扩散效应是面临的主要问题。
传统的设计是手动式，用涂有涂层的纤维头，其联用界面包括一个六通进样阀和一个解吸池，样品萃取后，SPME纤维头浸入解吸池中用适当的溶剂解吸，之后将阀切换至进样位置，用HPLC分析检测。Chen等人以稠环芳烃为对象对此接口进行了考察，证明其能提供足够小的进样体积以完成后继的色谱检测，其色谱行为与HPLC直接进样的结果差异不大。
手动式的SPME-HPLC萃取过程是手工操作，不能体现SPME分析速度快、效率高等特点，而且它不能完全实现自动化，因而很难成为一种常规的分析方法。1997年，Eisert等人就提出了一种自动进样的装置—管内SPME-HPLC装置。位于HPLC自动进样阀和取样针之间的是一根涂有SPME固定相层的GC石英毛细管，当处于进样位置时，经针头吸入样品溶液，使分析物分配到石英管壁的固定相上，切换到装样位置时，吸入溶剂，将被吸附(吸收)的组分转移到样品管中，再切换到进样位置，样品管内的溶液随流动相进入分析柱，进行色谱分析。这装置避免了手工操作，虽在洗脱富集时引入了溶剂，但解脱与进样分开，避免了峰扩宽。In-tube-SPME-HPLC方式采用自动进样装置完成萃取及解吸操作，其解吸过程可以定量进行，防止超载发生。这种试样溶液在毛细管中反复提升与排出的动态萃取过程，可使萃取平衡较快达到，而增加涂覆毛细管长度的方法可以提高萃取效率。而在上述的两种接口方式中，驱动解吸溶剂进行解吸以及驱动流动相将解吸液传输到色谱柱均使用同一个驱动泵。但在解吸过程及色谱柱均检测过程中，解吸溶剂与流动相的流速、组成不尽相同，需要在操作过程中予以更换，频繁改变流动相的流速往往导致固定相寿命缩短，而更改流动相比例又使比较基准发生变化，解吸溶剂用量过大又引起严重的柱外效应，降低灵敏度，因此Wu等人采用一种改进的接口来克服以上不足，它以一根固定相柱、一个十通阀、双泵(解吸泵和分析泵)来构造解吸进样系统。这种接口使进样体积减小，色谱峰的拓宽效应得到了较好的抑制，方便了流动相的更改，缩短了分析时间，对难以解吸而需要较大体积解吸溶剂的待测物质，可提高其灵敏度。
3.3 SPME-CE
毛细管电泳作为一种微量分离技术，由于其分离的快速性、高效性和样品需求量少等优点，成为生命科学中有效的分离手段。SPME和CE都是微量操作，有利于生物样品和药物等的预处理和分析分离。Li等人利用离线SPME-CE测定了体液中的巴比妥盐。他们用涂有塑胶化的聚氯乙烯的不锈钢丝进行固相微萃取，之后用几十微升的盐溶液将吸附物反萃取出来，进行正常的CE分析。1997年，Nguyen和Luong首先完成了SPME和CE的在线联用。他们将一段1.5厘米长，150微米内径，380微米外径毛细管与CE用毛细管相连，然后将固相微萃取纤维插入此毛细管中，利用流动相洗脱被吸附组分，带入CE毛细管柱进行分析。之后的Whang等人又在此基础上实现了零死体积联用，即在外径约40微米的石英纤维上，涂有约1微米厚的聚丙烯酸酯，与内径为75微米的毛细管柱直接相连，即可进行CE分析。
由于生物样品、医药方面将是本世纪发展的重点，SPME-CE联用在此方面有着无可比拟的优势，这方面的研究将是人们研究的重点。
3.4 SPME-MAE-GC
SPME进样不太适合检测固体样品中的难挥发物，利用微波辅助萃取(MAE)利用微波加热均匀、高效、选择性好等的特点。将SPME与MAE结合可以解决这一难题。在固体样品中加水，水能吸收微波能，再升高温度并增加压力，使分析物从固体中溢出，最后用SPME进一步富集。采用这种方法富集食品中的2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮(veltol(R))和2-乙基-3-羟基-4吡喃酮(veltol-plus(R))，再经GC-MS检测，检出限分别为10微克每升和2微克每升，RSD小于13%。
此外，有人将以石墨为涂层的萃取针为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，将两电极浸入到加有缓冲溶液的样品液中，待测的二胺在电极上发生氧化还原反应，二胺转化为碱形式保留在涂层上，再将其插入GC汽化室进行热解吸。Wu等人利用聚吡咯(PPY)的阴离子交换特性，将SPME与离子色谱联用，无须衍生就能测定水溶液中的阴离子。而Jager等人用PDMS为涂层材料的SPME与拉曼光谱联用测定水中的燃料油污染物。他们还将SPME与紫外消失波吸收光谱法(UV-EWA)联用检测水中芳烃，结果二甲苯的检出限为1.42毫克每升，苯为18.2毫克每升。
3.5 SPME/EC联用
SPME与电化学(EC)联用可分析带有电化学性质的待测物，包括金属离子等。待测物被导电涂层上微电极氧化或还原为合适的衍生物后，通过亲和力作用与涂层相吸附。如用SPME/EC来检测分析痕量水平的有机汞和无机汞。二价汞于水溶液被涂布有 10μm金层的140Hm外径的碳管电极吸附后，在GC进样口解吸，并由离子阱GC-MS检测。SPME/EC的联用拓宽了SPME的应用范围，能够利用待测物的电化学特性来萃取、浓集，以达到分离检测的目的。
3.6 SPME-MS技术
SPME可以成为质谱仪的进样工具。待测物于熔融石英纤维涂层处解吸，可快速导人离子化池，产生极窄峰并具有良好的信燥比率。质谱借助于分子碎片离子获取的信息可用于定性或物质鉴别。如顶空SPME与射频辉光放电质谱(radio frequency glow discharge mass spectrometry，rf-GDMS)联用检测四乙基铅(tetraethyllead，TEL)水溶液。引入rf-GDMS系统的有TEL和四甲基锡(tetramethyltin)。两者都产生能据此定性的良好图谱。
4.展望
目前利用固相微萃取技术开展的工作尚有一定的局限性，主要使用在分析挥发性、半挥发性物质，因此文献报道较多与气相色谱联用的技术有关，与液相色谱和毛细管电泳联用的技术尚不很成熟，文献报道较少。虽然固相微萃取技术近几年刚起步，但由于具有方法简单、无需试剂、提取效果好、变异系数小等诸多优点，已在环境、食品、生化、医学等领域有所应用。鉴于食品有干扰成分较多的特点，该技术在食品卫生检验中广泛应用还需要进一步做工作。
随着人们今后对仪器、技术的不断优化、评价和确认，SPME理论也将得到更为深刻的研究，SPME的应用将会更广泛，尤其是在生物试样、公安案件分析、化工、药品分析、国防及相关领域会有更为快速的发展。
随着性能更好的萃取头涂层材料的出现，如选择性更高的印记分子固定相、对有机溶剂有更为稳定的聚合物涂层材料等，制备涂层的方法的不断更新，SPME技术将适用到更为广泛的领域，分析功能也将会更为强大。而与此同时，随着各种联用技术的不断出现和成熟，，以及在联用技术中引入超临界流体洗脱、流动注射等技术，SPME的应用将更为广泛。