基于C、O稳定同位素及矿质元素对中国葡萄酒的地理分类

基于C、O稳定同位素及矿质元素对中国葡萄酒的地理分类

图1 中国五个葡萄酒产区位置
Fig.1 Location of five wine producing areas in China
2. 2。材料与方法
2.1样品准备
为保证样品具有产地真是属性，采集地理区域为中国重要葡萄酒产区，且样品均取自当地酒厂发酵罐中，葡萄品种均为酿酒品种，实验忽略品种、工艺及葡萄酒种类所产生的影响。为便于数据处理，对同一产区葡萄酒样品做统一代码标记：宁夏贺兰山产区（HL）、中国新疆产区（XJ）、云川藏产区（YCZ）、延怀河谷产区（YH）及河西走廊产区（HX），详细酒样信息见表1，产区具体位置见图1。
2.2.矿质元素分析
2.2.1材料及仪器
采用PerkinElmer ICP-MS Elan DRC-e 电感耦合等离子体质谱仪，配备40.68 MHz 自激式射频发生器、GemClean TM 十字交叉雾化器、Ryton TM 高分子惰性材料双通道雾化室（美国 Perkin Elmer 公司）；Lab Tech EHD36 电热消解板（北京莱伯泰科仪器公司）；微量移液器（德国Eppendorf 公司）。
MOS 级硝酸（北京化学试剂研究所）；去离子水（18.2 MΩ·cm 美国Millipore公司）；Ag、Al、As、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Ti、Tl、U、V和Zn 等58 种元素标准溶液（加拿大SCP SCICENCE公司，100 mg/L，介质为0.5 % HNO₃/2% HCl/1 % HF）。
2.2.2湿法消解流程
精确量取5mL酒样于消解管中，置于80-90℃电热板上加热驱赶乙醇至2mL，冷却至室温后加入5 mL浓硝酸和2mL过氧化氢，再置于110-120℃电热板上蒸发至2 m，冷却至室温后转入容量瓶，用超纯水定容至25 mL，待测。
2.2.3ICP-MS测定条件
仪器预热后经调谐液优化仪器参数，射频功率：1100 W；等离子气流量15 L/min；载气流量：0.94 L/min；辅助器气流量：1.2L/min；透镜电压：5.5 V；雾化室温度：2℃；蠕动泵转速：0.1r/s；采样流量：0.8 m L/min；采样深度：8.0mm；仪器软件推荐校正方程外标法定量，以2%硝酸为介质，标准溶液以0.25ppb、0.5 ppb、1.0ppb、5.0 ppb、10.0ppb及50.0ppb的浓度绘制标准曲线，以10ppb标准溶液Y作为内标。
2.3稳定同位素C分析
仪器：液相色谱同位素质谱仪（LC-IRMS）：美国ThermoFisher公司的DELTA VPlus 同位素质谱仪，配备Surveyor液相色谱与Isolink接口。硫酸、正磷酸(纯度≥99％)、过二硫酸钠(纯度≥99％)均购于 SigmaAlderich 公司，载气:氦气(纯度为99%），配制溶液存于棕色瓶内用前需使用超声波和真空过滤装置进行脱气。vodka乙醇标准样（浓度87.32%）δ¹³C值范围为-27.51到-27.55。
色谱条件、质谱条件及样品预处理：参考李学民方法，调整进样量，测定甘油碳进样体积为20μL，测定乙醇碳进样体积为5μL。选择相同色谱柱，将流动相流速调为0.3mL/min，氧化剂流速调为0.1mL/min。以vodka乙醇标准品稀释八倍为质控样，校正偏移结果。样品预处理稀释倍数选择100倍，其余条件均相同。
2.4稳定同位素O
采用同位素水平衡仪器（EQ-IRMS），来自英国Sorcon公司，对葡萄酒中O进行直接测定样品，将0.2mL添加到进样瓶中，用螺旋帽和硅胶模密封。将样品分组测定，用在相同瓶中以SMOW校准CO₂参考气为指控，每组包含所需样品6个，样品前后各5个装有CO₂参考气的进样瓶，起到给样品参考值和检测仪器稳定性的作用。测定样品前需进行CO₂充气处理，同位素平衡反应时间的初步实验结果表明，在50℃保温状态下平衡状态至少在12小时后出现，反应环境温度保持在23.5℃±0.1℃，数据选择测定数值不超过0.20‰。
2.5数据处理
采用SPSS24.0 软件对58个元素（已剔除低于检测限的元素），甘油碳，乙醇碳和水氧同位素数据进行ANOVA（Duncan's）、PCA及LDA。Origin2018软件作图。
3.结果与分析
3.1多元素分析
目前ICP-MS灵敏度高、检测限低，可以多种元素同时分析。对数据进行化学计量学方法分析，以检验各产地之间的差异，更准确反应葡萄酒的地理起源信息。采用方差分析和事后多重比较（Duncan's），从58种元素含量数据中识别出可以鉴别产地的关键因素。方差结果显示，显著水平p<0.05（下同）时，34个元素有显著性差异，其中Li、Ti、Cu、Sr、Mo、Rh、Ag、Mg、In、Eu、Lu、Ir、Th、Cs、Ru、Ta、Re、Os、Pt及水氧，共20元素在五个产区间有极显著性差异（P<0.01，下同）。其中HL、XJ和HX可以用Ir、Os、Pt、Li、Mg、Ge、In相互区分（winesamples from HL , XJ and HX can be mutually discriminated by Ir、Os、Pt、Li、Mg、Ge、In）；Li、Ti、Cu、As、Sr、Rh、Mg、Ru、Ta、Re可以将YCZ、YH分为一组，并与HL、XJ区分开；Gd、Dy、Er、甘油碳元素可以将YCZ地区与其他四个产区分开；Li、Mo、Rh、Ag、Mg、Tm、Yb、Lu、Ir、Th、Ta、Re、Os、Pt元素将HL和XJ区分开。没有任何一种矿质元素可以将五个产地同时分开，只有利用多元素分析方法才能有效鉴别产地。

如表二所示，可以看出大量元素Cu在XJ含量最高，约为YH两倍，与文献介绍新疆各地土壤中含铜量较高的结果一致；YH产区Cu含量较低，可能是因为降雨量少，葡萄不易染病，较少使用含铜多的波尔多液，使Cu在土壤中积累少。其余大量元素没有显现出葡萄酒更多的产地信息，可能由于土壤中大量元素本身含量较高，在葡萄种植过程中化肥的使用又对其含量造成影响，使大量元素在不同产地间差异不大。Li元素在HL含量最高，约为YCZ的4.7倍，可能是由于贺兰山地区有Li含量较高的多灰岩，植物吸收一些岩溶水中的Li元素，导致该地区葡萄酒中Li元素含量高。田海燕研究宁夏贺兰山地区土壤、葡萄及葡萄酒中矿质元素含量，结果表明Li可以作为HL鉴别的特征性元素。而云川藏地区的Cs、Rb元素含量最高，分别约为HX的5.5倍，HL的1.5倍，可能因为云川藏取样地区多锂云母，其中储存有较多Cs、Rb。N.S.ANGUS等人利用稀土元素对新西兰葡萄酒分类，研究发现在膨润土澄清时会增加稀土元素含量，而又因其本身元素含量低，最终认为稀土元素在产地鉴别上应用价值不大。本实验测定15种稀土元素中，仅有一种元素Eu在5个产地有极显著差异，其余稀土元素中均无差异。为更直观显示5个产地葡萄酒元素差异，对有极显著差异的元素作箱线图（如图2，其余元素箱线图见补充材料）。

Notes：箱线图中方框包括50%的数据，底部和顶部分别表示第一（Q1）和第三（Q3）四分位数，红线显示中位数（Q2），四分位距为Q3-Q1，Q3、Q1分别向上下延申1.5倍，期间距离称为内限，Q3、Q1分别向上下延申3倍，期间距离称为外限，在内限和外限之间用圆圈标记的点为温和异常值，在外限以外用*标记的为极端异常值。

图2 用于区分产地20种元素箱线图

Figure 2 is used to plot the boxes of 20 elements from differentorigins.

表2中国不同产地元素含量

Table 2 Element Contents inDifferent Origins of China

注：表中各元素浓度单位均为ppb，数据均为平均值±标准差。不同的小写字母表示不同区域之间的显著差异。

3.2同位素分析

由于中国版图跨纬度范围广，不同气候和土壤类型都会对葡萄酒产地信息产生影响，δ¹⁸O受多重因素影响，如：降水、温度、纬度、海拔、季节、灌溉，使不同地区δ¹⁸O不同，测定δ¹⁸O标准化后在-16到10之间。葡萄酒水δ¹⁸O值与降水和灌溉水有里良好相关性，一般降水受纬度效应和高程效应影响较大，即一般情况下纬度越高，海拔越高，降水中δ¹⁸O会越低。一般情况冰山融水δ¹⁸O偏负，深层地下水源δ¹⁸O偏正。如图2箱线图所示，明显看出δ¹⁸O在产地间有明显不同。由表2可知五个产地δ¹⁸O平均数，即河西走廊>新疆>贺兰山>延怀河谷>云川藏。但由于影响因素较多，δ¹⁸O平均数不能准确说明产地差异。具体产地差异具体分析：HL主要来自于银川北部，处于中纬度地区，该地区夏季降水δ¹⁸O和浅层地表水δ¹⁸O数据显示均偏负，葡萄酒水中δ¹⁸O和采收期降水和灌溉水有直接关系，该地区δ¹⁸O显示出稍偏负的特性。XJ所有样品取样位置所处纬度相差不多，其δ¹⁸O差异大多来自海拔、降水及灌溉水。昌吉地区平均海拔400多米，灌溉用水来自天山山脉冰山融水，不如焉耆地区偏正程度大；焉耆地区（包括和硕县、博湖县、焉耆县）由于海拔较低，干旱少雨，年蒸发量大于降雨量，而表面水¹⁶O蒸发和扩散速度比¹⁸O快，使葡萄吸收地表水中δ¹⁸O含量较高，导致该地区数值偏正更多；同样，哈密市降水少，蒸发量大，为降水的100倍，导致δ¹⁸O偏正；而伊犁地处天山腹地，降水充沛，使δ¹⁸O比所测新疆其他地区都偏负。YCZ是葡萄酒水δ¹⁸O最偏负的地区，主要受海拔影响，青藏高原是我国最高海拔葡萄种植园，四川以高山葡萄园闻名，云南地区同样海拔较高，海拔和δ¹⁸O通常呈负相关。HX明显偏正更多，原因可能是中国西北部地区，水源主要是江、河支流，多地属于干旱或半干旱地区，降水来自于有较高δ¹⁸O的表面水蒸发形成，导致葡萄酒水中δ¹⁸O在该地区较大。YH年平均降水也较少，灌溉水为浅层地下水，使数值偏负。实验取样地理位置广泛，年份跨度大，品种多样，导致影响δ¹⁸O数值因素较多，方差分析结果仍显示出δ¹⁸O有极显著差异，表明δ¹⁸O是区分产地的良好工具。

在测定样品中包括1997年到2014年间5个不同产地142个样品，乙醇δ¹³C标准化后在-16到-30之间，甘油碳在-22到-35之间，如图3箱线图所示，可以更直观看出乙醇δ¹³C产地差异较甘油δ¹³C更小，δ¹³C主要与光合作用相关，而光合作用主要受年份和葡萄品种代谢的稳定影响，对于区分掺假葡萄酒和不同品种葡萄酒有较好作用，若单独使用甘油δ¹³C、乙醇δ¹³C无法鉴别葡萄酒产地，与H、O同位素结合分类效果更好。

为更有效鉴别葡萄酒产区，明确各因素在区分葡萄酒产地产生的影响，采用Wilks Lambda test (p<0.01)and an F-statistic factor对五个产地34种元素142个样品进行逐步判别分析，数据样本分为100个样本的训练集和42个样本的测试集，样本集和测试集均包括五个产地。逐步判别结果显示建立了四个典型判别函数，典型判别函数1和Re、水氧、Pt、Lu、Ta、Tm、Rb、甘油δ¹³C、As及Mn最大绝对相关，典型判别函数2和Li、Rh、Th、Pb及Eu最大绝对相关，典型判别函数3与Mo、Ir、Mg、Ti、Ru、Se、Cu、Nb、Cd、Ge、Cs及Os最大绝对相关，典型判别函数4与Ag、Bi、In、Be、Zr及Hf元素最大绝对相关，四个函数有显著性差异，所以四个典型判别函数均有意义。分析结果将Li、Mo、Ag、Mg、Ir、Th、Ta、Re、Pt及葡萄酒水δ¹⁸O引入判别模型（表3），分类时选出对原始数据组的分类正确率达到90.8%，对YH产地的判别正确率均达到100%，HL样品有一个被误认为是YCZ，一个被误认为是YH；XJ有一个被误认为是HL，有三个被误认为是HX；YCZ样品有一个被误分为HL，四个被误分为YH；HX有两个被误分为XJ，142个样品中有13个样品被错误分类。又进行交叉检验来验证模型有效性，其正确率达到87.3%。判别分析结果提取二个特征值，累计得分即可达到90.2%，将数据标准化后带入标准化典则判别函数中，成功将HL、XJ、YCZ和YH、HX分开（图6），可以看出同一产区数据集中在同一区域，不同产区有其特定的区域，但仍有个别YH会和HL、YCZ混淆，HX会和XJ混淆，可能是因为本次使用样数量有限，取样产区地理位置跨度大，对红葡萄酒和白葡萄酒及葡萄品种不做区分，这些原因使相同产区间存在重叠现象，因此需要引入更多数据，建立更精细的判别函数。

表3 HL、XJ、YCZ、YH、HX交叉检验判分类结果

Table3 Classification results of HL, XJ, YCZ, YH and HX cross-tests

*将样本中的相应值替换为上述判别式，并且将具有最大数据的一个值视为被划分为样本所属的类别。