HPLC定性叶黄素及条件摸索

HPLC定性叶黄素及条件摸索

通过查阅文献，使用上述条件进行测试时发现，无论怎么改变有机相比例，即使100%有机相都未见叶黄素出峰，色谱图及光谱图如下图3所示。

图3 接分离柱下色谱图及光谱图

从以上色谱图可以看出，只有系统倒峰及杂峰，结合3D光谱图在高波长446nm处未见吸收峰，由此可以判断样品未出峰，极有可能被牢牢地吸附在色谱柱中，因为通过叶黄素的几个结构式可以看出其碳链较长，与色谱柱中十八烷基的作用力较强，导致很难进行洗脱。为了进一步验证样品被吸附在色谱柱中，在其它条件不变的情况下，仅拆下色谱柱，用两通将管路连接，再进一针样品，色谱图及光谱图如下图4所示。

图4 不接分离柱下色谱图及光谱图

由上图可以看出，在不接分离柱的情况下，在高波长处有吸收，那么可以确定C18柱对叶黄素的保留太强。接下来最直接的办法便是更换色谱柱了，将C18色谱柱换为碳链更短的C8柱进行分离，条件如下所示。

本以为换上C8色谱柱后，能够按照预期出峰，但是事与愿违！仍然无论怎么改变有机相比例，即使将甲醇比例增加为100%都不奏效，那么接下来只能通过改变流动相来降低其保留了。

考虑到极性水＞甲醇＞乙腈＞乙醇，那么我们可以通过降低流动相的极性，依据相似相溶来洗脱叶黄素，由于在配置样品时使用的是乙醇进行溶解，那么可以将极性很大的水相替换成极性较弱的乙醇，使用低极性的甲醇和乙醇的一个配比来将叶黄素进行分离。条件如下所示。

按照上述条件，通过不断改变甲醇与乙醇的配比，终于叶黄素出峰！由于叶黄素有多个异构体，因此出的是一簇峰，色谱图及光谱图如下图5所示。

图5 叶黄素色谱图及光谱图