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荧光定量PCR实验失败原因分析——荧光信号检测出了问题

栀子花开

2020/06/04
解密双螺旋团队

荧光定量PCR实验失败原因分析
——荧光信号检测出了问题

近日某实验室来电，反映其荧光定量PCR仪在成功检测了一次病毒核酸后，连续几次检测均失败，表现为阳性对照也无Ct值，请求给予技术支持。

1背景

该实验室荧光定量PCR仪系进口品牌，今年4月份安装调试，当时检测结果较理想。5月份该实验室进行了一次病毒核酸检测，提取采用柱式DNA提取试剂盒，未设阴性对照和阳性对照；扩增采用配套的核酸扩增试剂，设置了阴性对照和阳性对照，检测结果较理想。但在后续的检测工作中，却连续多次实验失败，表现为整个扩增过程荧光信号均为一条几乎无起伏的直线。

2思路

影响荧光定量PCR检测结果的因素可分为三个阶段，一是核酸提取，二是核酸扩增，三是荧光信号检测。为了分析是哪个阶段出了问题，我们设计了以下方案：

第一步：利用已知结果的核酸+该实验室的扩增试剂，看有无检测结果。如有则说明核酸提取环节存在问题，如无则说明可能是核酸扩增环节或荧光信号检测存在问题，继续进行第二步分析；

第二步：利用已知结果的核酸+经验证可以得到结果的扩增试剂（本实验室在用的扩增试剂及引物探针），看有无检测结果。如有则说明核酸提取环节存在问题，如无则说明可能是荧光信号检测存在问题。

3分析验证

方案确定后，带上本实验室已知结果的核酸（包括Ct值25、28、31、34及阴性），以及本实验室在用的扩增试剂及引物探针，到该实验室开展分析验证。

第一步：利用已知结果的核酸+该实验室的扩增试剂上机检测，结果荧光信号仍为一条几乎无起伏的直线。说明可能是核酸扩增环节或荧光信号检测存在问题。为明确究竟是何原因造成实验失败，继续开展第二步分析验证。

第二步：利用已知结果的核酸+经验证可以得到结果的扩增试剂上机检测，结果荧光信号还为一条几乎无起伏的直线。因本次使用的扩增试剂和引物探针是本实验室一直在用的，已知可以得到正确的扩增结果，所以初步判断可能是荧光信号检测存在问题。

到此，分析验证告一段落，实验失败极有可能是荧光定量PCR仪出现故障，最大可能是荧光信号检测存在问题。目前，该实验室已电告设备厂家，要求派工程师上门维修。

4思考

荧光定量PCR实验失败看似非常头痛，实则不然。只要理清思路，逐一分析验证核酸提取、核酸扩增、荧光信号检测各个环节，即可快速判断问题所在。

另外还有一点不吐不快的感受，作为一个世界著名品牌产品，实验室选择它的出发点就是该设备的准确性和稳定性，但这台设备只进行过一次检测就出现故障，实属不该。

5续

最新消息，据该实验室反馈，厂方工程师上门检修，发现是作为荧光光源的灯泡坏了。更换灯泡后，该实验室已能检测出正确结果。

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