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荧光定量PCR实验失败原因分析——ROX设置不当

  • 栀子花开
    2020/06/05
    解密双螺旋团队
    • 私聊

PCR

  • 荧光定量PCR实验失败原因分析——ROX设置不当

    这事发生在用荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒核酸的时候，作为荧光定量PCR实验失败的一个案例，写出来供大家借鉴。

    1背景资料

    2018年11月底，省疫控中心开展非洲猪瘟病毒核酸检测培训，随后进行检测资格授权所需的能力考核。因当时国内尚无商品化的非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒，采用的办法是qPCR预混液及下发的引物探针，考虑到系统内多数实验室的荧光定量PCR仪是ABI7500，同时还下发了ROX。

    2开展检测

    培训结束后马上领样品回来检测，结果比较理想，顺利通过了能力考核，取得检测资格授权。随后对采集的样品开展检测，幸好均未检出非洲猪瘟阳性样品。

    3实验失败

    随着检测工作的发展，qPCR预混液即将用完，而商品化检测试剂盒也已有上市，遂改用商品化试剂盒检测。第一次改用试剂盒，慎重起见将原先能力考核的样品用于验证，结果实验失败，扩增曲线图如下：



    4分析原因

    回顾检测过程，核酸提取、反应体系配置、反应条件设置等均无问题，只是原来我们每次在反应体系中均添加ROX，在软件中也设置了ROX参照，这一次……我们尽管没有添加ROX，但还是习惯成自然，还是在软件中设置了ROX参照，会不会是这里设置不当？

    说干就干，在软件中将参照物由ROX改为NONE，刷新一下结果，果然是参照设置不当造成的。

    扩增曲线如下：



    5讨论

    对于ABI7500来说，添加了ROX，最好在参照中也设置为ROX，这样可以确保您获得均一的定量PCR实验结果。因为据介绍，使用ROX可以达到以下效果：

    ——校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变；

    ——为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响；

    ——均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异；

    ——均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。

    但在未添加ROX的情况下，ABI7500软件却千万不能将参照设置为ROX，否则会造成意想不到的后果。
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  • dadgoh

    第1楼2020/10/22

    应助达人

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  • dadgoh

    第2楼2020/10/23

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  • 蛋挞公主

    第4楼2021/02/02

    感谢分享，学习了

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  • BGFLASER

    第5楼2021/12/13

    感谢分享，学习了。

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  • Ins_a3793c76

    第6楼2023/05/16

    你好 请问该如何在跑完之后改变参照物并刷新结果呢

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  • 123

    第8楼2023/06/01

    应助达人

    谢谢分享！

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  • rqycn

    第9楼2023/08/24

    学习了，多谢分享。

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