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荧光定量PCR实验失败原因分析——荧光信号检测出了问题
栀子花开
2020/06/04
解密双螺旋团队
私聊
PCR
荧光定量
PCR
实验失败原因分析
——荧光信号检测出了问题
近日某实验室来电,反映其荧光定量
PCR
仪在成功检测了一次病毒核酸后,连续几次检测均失败,表现为阳性对照也无
Ct
值,请求给予技术支持。
1
背景
该实验室荧光定量
PCR
仪系进口品牌,今年
4
月份安装调试,当时检测结果较理想。
5
月份该实验室进行了一次病毒核酸检测,提取采用柱式
DNA
提取试剂盒,未设阴性对照和阳性对照;扩增采用配套的核酸扩增试剂,设置了阴性对照和阳性对照,检测结果较理想。但在后续的检测工作中,却连续多次实验失败,表现为整个扩增过程荧光信号均为一条几乎无起伏的直线。
2
思路
影响荧光定量
PCR
检测结果的因素可分为三个阶段,一是核酸提取,二是核酸扩增,三是荧光信号检测。为了分析是哪个阶段出了问题,我们设计了以下方案:
第一步:利用已知结果的核酸
+
该实验室的扩增试剂,看有无检测结果。如有则说明核酸提取环节存在问题,如无则说明可能是核酸扩增环节或荧光信号检测存在问题,继续进行第二步分析;
第二步:利用已知结果的核酸
+
经验证可以得到结果的扩增试剂(本实验室在用的扩增试剂及引物探针),看有无检测结果。如有则说明核酸提取环节存在问题,如无则说明可能是荧光信号检测存在问题。
3
分析验证
方案确定后,带上本实验室已知结果的核酸(包括
Ct
值
25
、
28
、
31
、
34
及阴性),以及本实验室在用的扩增试剂及引物探针,到该实验室开展分析验证。
第一步:利用已知结果的核酸
+
该实验室的扩增试剂上机检测,结果荧光信号仍为一条几乎无起伏的直线。说明可能是核酸扩增环节或荧光信号检测存在问题。为明确究竟是何原因造成实验失败,继续开展第二步分析验证。
第二步:利用已知结果的核酸
+
经验证可以得到结果的扩增试剂上机检测,结果荧光信号还为一条几乎无起伏的直线。因本次使用的扩增试剂和引物探针是本实验室一直在用的,已知可以得到正确的扩增结果,所以初步判断可能是荧光信号检测存在问题。
到此,分析验证告一段落,实验失败极有可能是荧光定量
PCR
仪出现故障,最大可能是荧光信号检测存在问题。目前,该实验室已电告设备厂家,要求派工程师上门维修。
4
思考
荧光定量
PCR
实验失败看似非常头痛,实则不然。只要理清思路,逐一分析验证核酸提取、核酸扩增、荧光信号检测各个环节,即可快速判断问题所在。
另外还有一点不吐不快的感受,作为一个世界著名品牌产品,实验室选择它的出发点就是该设备的准确性和稳定性,但这台设备只进行过一次检测就出现故障,实属不该。
5
续
最新消息,据该实验室反馈,厂方工程师上门检修,发现是作为荧光光源的灯泡坏了。更换灯泡后,该实验室已能检测出正确结果。
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