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CNS_04.001_丁基羟基茴香醚(BHA)

食品添加剂

  • 李敬贤

    《丁基羟基茴香醚及其检测》



    摘要:丁基羟基茴香醚是在食品中常用的氧化剂。2017年,世界卫生组织下属机构,国际癌症研究中心发布了致癌物清单,其中丁基羟基茴香醚被列为2B类。这意味着虽然它对人体致癌的证据有限,但仍然留有对人类致癌的可能。同时,有一系列证据显示,作为常用私聊添加剂的丁基羟基茴香醚,对鼠、家禽类有致突变作用。[1]所以,在食品检测时,对其进行定性定量的检测是必要。而为了探究其毒性来源于何处,我们有必要探究其作为抗氧化剂的抗氧化机理,以及合成路线,以分析排除其他因素致毒的干扰。最后,我们将从分析化学手段分析如何对丁基羟基茴香醚进行检测。

    一、丁基羟基茴香醚

    1. 基本性质

    丁基羟基茴香醚是白色或为黄色蜡状晶体粉末,带有酚类的特异臭气和刺激性气味,如下图所示,一般由两种异构体混合物组成(3-BHA/2-BHA)。

    图1 构成BHA的两种混合异构体



    其熔点由于是混合物的原因,通常随混合比的不同而出现波动,比如3-BHA占95%的BHA熔点为62℃。总的来说,丁基羟基茴香醚的熔点在57~65℃之间。而由于相同原因,BHA沸点大致在264~270℃之间。同时,BHA不溶于水,在常见溶剂和油脂中的溶解度大致在几十克每毫升,比如在花生油中为40 g/100 mL

    作为一种带有酚羟基的抗氧化剂,在被提取出来时具有单酚型特征的挥发性。但对热很稳定,对光则容易被氧化,外观上看起来则是颜色加深,在弱碱性条件下较稳定。

    2-BHA相比,3-BHA的抗氧化性随着异丁基对酚羟基位置更远,自由基抗氧化作用也随之强化,增强的倍数大致在1.5~2倍之间。同时,二者混用可以增强抗氧化性能。对食品来说,用量控制在0.02%比控制在0.01%抗氧化效果增强10倍。但是用量增加超过0.02%后抗氧化效果反而会下降。[3]

    2. 国家标准

    根据我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)中规定:二丁基羟基甲苯可用于食用油脂、油炸食品、干鱼制品、饼干、方便面、速煮米、果仁罐头、腌腊肉制品、早餐谷类食品,最大食用量为0.2g/kg。BHT与BHA混合使用时,总量不得超过0.2g/kg;BHT和BHA与PG(没食子酸丙酯,Proply Gallate)混合使用时,BHA、BHT(2,6-二丁基羟基甲苯)总量不得超过0.1g/kg,PG不得超过0.05g/kg。最大使用量以脂肪计。此外,也可用于胶姆糖配料。

    3. 应用范围

    丁基羟基茴香醚作为脂溶性抗氧化剂,适宜油脂食品和富脂食品。由于其热稳定性好,因此可以在油煎或焙烤条件下使用。另外丁基羟基茴香醚对动物性脂肪的抗氧化作用较强,而对不饱和植物脂肪的抗氧化作用较差。丁基羟基茴香醚可稳定生牛肉的色素和抑制酯类化合物的氧化。

    丁基羟基茴香醚与三聚磷酸钠和抗坏血酸结合使用可延缓冷冻猪排腐败变质。丁基羟基茴香醚可稍延长喷雾干燥的全脂奶粉的货架期、提高奶酪的保质期。丁基羟基茴香醚能稳定辣椒和辣椒粉的颜色,防止核桃、花生等食物的氧化。将丁基羟基茴香醚加入焙烤用油和盐中,可以保持焙烤食品和咸味花生的香味。延长焙烤食品的货架期。丁基羟基茴香醚可与其他脂溶性抗氧化剂混合使用,其效果更好。如丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯配合使用可保护鲤鱼、鸡肉、猪排和冷冻熏猪肉片。丁基羟基茴香醚或二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯和柠檬酸的混合物加入到用于制作糖果的黄油中,可抑制糖果氧化。[3]



    丁基羟基茴香醚一直作为常用抗氧化剂使用是因为相比于其他抗氧化剂,它具有自己的优势。它不像没食子酸丙酯会与金属离子配合,不想二丁基羟基甲苯一样不溶于丙二醇。同时,丁基羟基茴香醚除了抗氧化作用还有很强的抗菌力,用质量分数为0.015%的丁基羟基茴香醚即可一直金黄色葡萄球均,用量达到0.028%即可阻止寄生曲霉孢子生长,进而阻碍黄曲霉素的生成。

    BHA对动物脂肪的抗氧化作用较强,对不饱和的植物油的抗氧化性较弱。BHA可以在油煎或烘烤的温度下使用,并在此过程中随油进入食品,从而对食品起到抗氧化作用。BHA具有一定的熏蒸性,因此它可以通过加到食品包装中而对食品起抗氧化作用。BHA可单独使用,也可与其他抗氧化剂共同使用。单独用于起酥油,其效果不如BHT、TBHQ,但在乳剂中效果比BHT好。

    二、丁基羟基茴香醚的合成与作用机理

    1. 丁基羟基茴香醚的合成

    丁基羟基茴香醚的合成主要来自于苯的对二取代物。

    (1)对苯二酚路线

    用对苯二酚和叔丁醇,以磷酸为催化剂,在101℃下反应,制的中问体叔丁基对苯二酚,然后再以叔丁基对苯二酚与硫酸二甲酯在氮气氛中,加热回流反应18小时,冷却后用苯提取,苯提取液用热水洗涤,蒸除苯后,得粗品,减压蒸馏,得丁基羟基茴香醚。

    (2)对氯苯酚路线

    以对氯苯酚为原料,将其与异丁烯混合,在磷酸存在的条件下反应。得到产品为2,4,6-Cl(Me3C)2C6H3OH和24-Cl(Me3C)C6H3OH的混合物,前者与甲醇钠在甲醇溶液中发生Williamson反应,即得产品3-BHA。

    (3)对甲氧基苯酚路线

    对甲氧基苯酚的合成关键在于叔丁基与苯环的结合,因此缩合催化剂的选择最重要,比较早前的工艺中使用质子酸作为催化剂,如浓硫酸、磷酸、氢氟酸等,但反应条件较为苛刻,而且需要较高的温度。据日本专利报道以离子交换树脂为催化剂,反应温度65~75℃,总产率可达到68.5%,其中3-BHA的含量为51.8%,所得产品中3-BHA为90%。据另一日本专利报道,3-BHA的含量高达82.3%,对甲氧基苯酚的转化率为87%,这是一般无机酸催化剂所不能达到的。

    (4)对氨基苯甲醚路线

    先合成对羟基苯甲醚即对甲氧基苯酚,然后再通过烷基化反应,制备BHA。具体工艺如下:在冰浴搅拌下,加入对氨基苯甲醚和亚硝酸钠(摩尔比1:1.15),在硫酸存在下进行重氮化反应,反应完成后保温过滤,将滤液滴加于热的水解反应液中水解,生成对羟基苯甲醚。然后即可用蒸汽提馏出来,冷凝下来的对羟基苯甲醚溶液用有机溶剂进行萃取,经浓缩蒸馏除去溶剂,可得对羟基苯甲醚,平均收率为84.7%。

    (5)对羟基苯甲醚路线

    将对羟基苯甲醚、叔丁醇和溶剂加热溶解,再将此混合试剂加入到事先预热好的催化剂中,在混合良好的反应器中进行反应,15min后反应完毕。取样用高效液相色谱测定未反应的叔丁醇,当取样化验结果合格,反应即可停止。静置分层,收集有机物,然后采用蒸馏的方法除去有机溶剂,在经高真空减压蒸馏,得BHA产品,收率为77.8%。[3]

    2. 丁基羟基茴香醚的抗氧化机理

    天然油脂暴露在空气中会自发地发生氧化反应,生成低级脂肪酸、醛、酮等, 产生恶劣的酸臭和口味变坏等,是油脂及含油食品败坏变质的主要原因。油脂的自动氧化遵循自由基反应机制,首先脂肪分子被热、光或金属离子等自由基引发剂活化后,分解成不稳定的自由基R·和H· 。当有分子氧存在时,自由基与O2反应生成过氧化物自由基,此过氧化物自由基又和脂肪分子反应,生成氢过氧化物和自由基R· ,通过自由基R·的链式反应又再传递下去,直到自由基和自由基或自由基和自由基失活剂相结合,产生稳定化合物时,反应才结束。此过程中产生许多短链羰基化合物, 如醛、酮、羧酸等,是产生酸败和劣味的主要物质, 而大量过氧化物的存在,对人体也会产生不良结果。[4]丁基羟基茴香醚除了可以与自由基发生反应,还可以螯合金属离子(如铜离子和铁离子)进而延缓脂肪氧化,使肉制品具有稳定的货架期。[5]



    三、毒性研究

    对食品安全的影响一般认为BHA毒性很小,较为安全。根据以上文献,我们发现丁基羟基茴香醚虽然被分为2B类致癌物,对人体致癌证据尚不完全,但从自由基机理我们不难怀疑当大量使用时,作为自由基链式反应的转移终止中间体,可能会延长自由基寿命。在人体以外的动物实验中,丁基羟基茴香醚同样表现出了各种各样的毒性,这样的毒性不仅会影响农渔业生产,其自由基反应的难代谢产物同样会因为富集作用对人类健康产生影响。

    比如,对小鼠(雄)经口LD50为1.1g/kg,对大鼠经口LD50为2.09/kg。日本于1981年用含2%BHA料喂大白鼠两年,发现其前胃发生扁平上皮癌,故自1982年5月限令只准用于棕榈油和棕榈仁油中,其他食品禁用。[3]

    故以下将丁基羟基茴香醚对动植物毒性影响的文献稍作整理:

    1. 丁基羟基茴香醚对剑尾鱼的毒性

    BHA试验分别设置5个间隔较大的浓度梯度和空白对照组。试验在1L的烧杯中进行, 内盛800 mL试验液, 每个浓度设3个平行, 每只烧杯中放4尾鱼, 雌、雄鱼各2条。实验开始后第0、24、48、72、96 h时观察并记录各容器实验鱼的存活情况。

    结果,BHA在预试验中96 h内使剑尾鱼100 %死亡的浓度为5 mg·L-1,因此, BHA属于高毒, 对剑尾鱼产生急性毒性。[6]

    2. 大口黑鲈对丁基羟基茴香醚的耐受性评价

    本试验依据农业部《饲料原料和饲料添加剂水产靶动物耐受性评价试验指南( 试行) 》进行。在大口黑鲈的基础饲料中分别添加0、150、300、1 500 mg / kg的BHA ,其中150 mg / kg为最高推荐添加剂量,而300和1500 mg /kg分别是它的2和10倍,制成4种直径为2.0 mm的硬颗粒料,自然晾干后备用。本试验设计4个组,对应饲喂4种试验饲料,每组6个重复(桶),每桶30尾鱼。试验鱼每天表观饱食投喂2 次,投喂时间分别为08: 00和16: 00。定期检测水质,水质条件保持在溶氧(DO)浓度> 7. 0 mg /L,氨氮( NH4+-N ) 浓度< 0. 3 mg /L,pH 7.5 ~ 8.5,水温(23±1)℃ 。养殖试验从2014年7月15日到2014年9月23日,共70 天。

    抗氧化测试通过试剂盒进行,按照说明书测定血浆及各组织中抗氧化指标,所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。桶随机取5 尾鱼,采血制备血浆并取肝脏、心脏和肌肉,放在-80℃待测。

    结果表面,饲料中添加150 mg /kg的BHA对大口黑鲈具有一定的脂肪代谢促进作用和抗氧化保护功能,且对大口黑鲈是安全的,安全系数为10 倍。同时,本试验中D1500 组血浆中GSH-Px活性最高,可能原因是高剂量的BHA对GSH具有显著诱导作用,促进GSH-Px与底物GSH和H2O2反应生成水和氧化型谷胱甘肽( GSSG) 。[7]

    3. 对各种生物的LD50(半数致死量)

    小鼠口服1100mg/kg(bw)(雄性),小鼠口服1300mg/kg(bw)(雌性);大鼠口服2000mg/kg(bw),大鼠腹腔注射200mg/kg(bw);兔口服2100mg/kg(bw)。

    四、丁基羟基茴香醚的检测

    丁基羟基茴香醚(BHA)一般同时与同属于抗氧化剂,并且经常混合使用的2,6-二叔丁基对甲酚(NHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)同时测定。目前已经建立起了测定食品中抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚 (BHA),2, 6-二叔丁基对甲酚 (BHT) 和特丁基对苯二酚 (TBHQ)的液相色谱法和气相色谱法。

    而随着国家近几十年对食品安全越来越重视,对丁基羟基茴香醚等一系列食品抗氧化剂的检测都提出了明确而合理的检测手段。国家标准从GB/T 23373-2009更新到了GB 5009.32-2016。说明随着技术手段的发展,高效液相/气象色谱的普及,国家标准同样也在更新。同时,在学术领域,对丁基羟基茴香醚的测定同样也在不断进行深化探究。

    1. 方法一

    方法先用石油醚提取食品中的油脂, 油脂中抗氧化剂用13ml甲醇提取后, 离心, 重复两次, 合并提取液, 旋蒸浓缩到5ml, 定容至10ml, 冷冻1h,上清液分别注入到条件优化好的液相色谱和气相色谱中进行色谱分析。结果液相测定BHA、BHT和TBHQ的定量下限分别为0.002、0.010和0.002 g/kg,气相测定BHA的定量下限分别为0.003、0.002和0.005g/kg, 两个方法的加标回收率为82.8%~109.0%。两种仪器分析方法结果比对差异无显著性。结论所建立的前处理方法简单、可操作性强, 两种仪器方法的比对结果一致。[8]

    2. 方法二

    样品前处理称取2 g(精确至0.01g)油样或提取的脂肪置于离心管中, 加入10 mL甲醇, 在旋涡混合器上振荡提取1min,5000 r/min离心3 min, 吸取甲醇层置于第二支离心管中, 如上操作分别用5.0 mL提取两次, 合并甲醇层置于第二支离心管中, 混匀后, 置于-18℃冷冻半小时, 取出后立刻过0.45 μm有机相滤膜, 滤液待上机测定。[9]

    3. 方法三(PSE-HPLC

    该方法采用正交试验对影响PSE萃取效率的温度、压力、萃取溶剂、萃取时间进行优化,联合HPLC进行测定,并确定分别以BHA提取量、BHT提取量以及总量为评价指标的最优条件。结果:PSE-HPLC法测定BHT和BHA的相对标准偏差(RSD)为0.5%~3.1%,并且在1.0~200.0 μg/mL范围内色谱峰面积与组分质量浓度均有很好的线性相关性(r≥0.9997),检出限为0.05 μg/mL,在最优条件下的回收率为92.60%~97.80%。结论:PSE-HPLC法简便、快速、效率高,方法的重现性、线性相关性以及检出限理想,适用于食品中BHT和BHA含量及两者总量的同时快速检测。[10]

    4. 加压毛细管电色谱法

    称取25 mg丁基羟基茴香醚,移入25mL棕色容量瓶中,以乙腈定容至刻度,制成1mg/m L的标准贮备液,低温保存。用乙腈溶液将上述标准储备液逐级稀释为2、5、10、50、100、200μg/m L的系列标准混合溶液,置于冰箱保存备用。准确称取大豆油5 g(精确至0.001 g),置于具塞离心管中,加入8 mL甲醇,漩涡混合3 min,静置2 min,以3000 r/min离心5 min,用微量移液器取出上清液,残余物每次用8 mL甲醇提取2次,合并上清液与甲醇提取液,用氮吹仪于50 ℃下浓缩至近干,以适量甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶。

    加压毛细管电色谱分离体系中需要添加可导电的酸、碱或者缓冲盐溶液,以保证施加电压后形成稳定的电场及电渗流,实验中分别考察了三氟乙酸、甲酸以及醋酸铵改性剂等对分离的影响。结果表明,三氟乙酸以及醋酸铵缓冲溶液体系下,色谱峰的响应值变低,且加电后的电流值过高,容易引起焦耳热效应,造成基线噪声较大;而添加甲酸后,可有效改善色谱峰形,减少拖尾,在施加电场后,电流稳定,基线平稳。同时注意到,添加过量的甲酸会造成流动相体系的pH过低,不利于电渗产生,所以本实验最终选择甲酸的浓度为0.05%。

    以加压毛细管电色谱法(pCEC)为平台,在8 min内可以完成4种抗氧化剂的同时测定。该方法简单快速,准确可靠,借助pCEC电渗流和压力流的双重推动力,能将丁基羟基茴香醚中的杂质与主成分分开,提高了分析速度和分离效能。pCEC作为一种微分离技术,实际分析流速只在微升级甚至纳升级,且样品用量只有几纳升,大大节省了检测成本,具有实用推广价值。

    *参考文献:

    [1]世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单, 2B类致癌物, 2017

    [2]李毅民,胡燕平,李彦红.叔丁基-4-羟基茴香醚致突变性研究[J].癌变.畸变.突变,2000(01):34-36.

    [3]周家华,崔英德,曾颢等编著.食品添加剂 (第二版):化学工业出版社,2008:55-57

    [4]李银聪,阚建全,柳中.食品抗氧化剂作用机理及天然抗氧化剂[J].中国食物与营养,2011,17(02):24-26.

    [5]刘立群,喻倩倩,刘毅,戴瑞彤.天然抗氧化剂作用机理及在肉类制品中的应用研究进展[J].肉类研究,2017,31(06):45-50.

    [6]梁惜梅,鹿金雁,聂湘平,王翔,李凯彬.饲料添加剂叔丁基对羟基茴香醚和抗生素诺氟沙星对剑尾鱼的毒性效应[J].环境科学学报,2010,30(01):172-179.

    [7]于利莉,薛敏,王嘉,韩芳,郑银桦,吴秀峰,吴立新.大口黑鲈对饲料中丁基羟基茴香醚的耐受性评价[J].动物营养学报,2016,28(03):747-758.

    [8]杨杰,方从容,杨大进.液相色谱法和气相色谱法测定食品中抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对甲酚和特丁基对苯二酚的研究和比对[J].卫生研究,2013,42(01):114-118.

    [9]陈秀明,林海丹,梁小茹.食品中叔丁基羟基茴香醚(BHA)与2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的测定[J].现代测量与实验室管理,2012,20(01):16-18.

    [10]林太凤,刘阳,王慧琴,郑大威,罗云敬,张淑芬.PSE-HPLC法测定食品中叔丁基羟基茴香醚和2,6-二叔丁基羟基甲苯[J].食品科学,2010,31(14):254-257.

    [11]王晓曦,王彦,李静,茹鑫,闫超.加压毛细管电色谱法同时测定植物油中4种抗氧化剂[J].食品工业科技,2015,36(09):273-277.
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