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新型外泌体分离方法

  • 小矮马
    2021/08/01
    小矮马
  • 私聊

化学药分析

  • 新型外泌体分离方法

    肿瘤细胞来源的外泌体在分子水平上促进肿瘤的进展、侵袭和转移。因此,在探索细胞间信号传导,分析功能分子成分(蛋白质、mRNAmicroRNA)前需要有效的检测和分离肿瘤源性外泌体的能力,这可能为癌症诊断和预后提供关键信息。

    1基于尺寸排阻的外泌体分离技术

    外泌体是直径在30-200 nm的囊泡,其尺寸小于绝大部分的细胞外囊泡,因此,基于这一特性,可利用具有限制相对分子量或大小的过滤器来分离外泌体。目前,最常用的基于尺寸的外泌体分离技术就是超滤离心法。该方法是一种基于悬浮颗粒或聚合物大小的外泌体分离技术,小于膜孔径的物质会通过过滤膜,大于膜孔径的物质被截留在膜上。超滤法比UC速度更快,且不需要特殊的设备,已有研究表明该方法可以成功从0.5 mL尿液中分离外泌体。



    目前已经开发了一种适合无细胞样品的商用外泌体分离试剂盒,兼具外泌体分离和RNA提取的功能。如图所示,该试剂盒利用注射过滤器双层膜结构,当样品通过两层膜时,较大的细胞外囊泡(如凋亡小体和微囊泡)被保留在上层膜上,而外泌体捕获在下层膜上。与UC和外泌体沉淀法相比,超滤法从尿液中获得的外泌体RNA产量最高。该方法的主要缺点在于分离的外泌体容易堵塞过滤膜,导致分离效率下降。此外,该方法可能会导致囊泡的变形和破裂,影响下游分析的结果。

    另一种基于尺寸的外泌体分离方法是尺寸排除色谱法SEC。该方法利用多孔固定相将悬浮颗粒和聚合物按照大小进行分类流体动力半径小的物质能够通过孔隙,而流体动力半径较大的物质会被截留在孔隙上。此外,该方法结合其他方法使用可取得更好的效果例如,与单纯的超滤法或UC相比,该方法分离的外泌体结合后续超速离心可以提高尿外泌体的捕获效率,从而有利于寻找肾脏疾病生物标志物。该方法分离外泌体主要缺点在于干扰物多孔隙极易堵塞,导致色谱柱重复率低,分离效率较低。

    1-3 连续过滤原理图[68]

    Figure 1-3 Schematic illustration of sequential filtration[68]




    2基于聚合物沉淀的分离技术

    聚合物沉淀技术是通过添加水性聚合物使外泌体溶解度或分散性改变,减少外泌体的水合作用,使外泌体沉淀以达到分离的技术。通常使用分子量为8000 Da的聚乙二醇(PEG)与样品共孵育,4℃过夜后,用低速离心或过滤法分离含有外泌体的沉淀物。目前,已开发了一系列聚合物沉淀试剂盒可用于体液和培养基中外泌体的分离。聚合物沉淀分离外泌体的方法易于使用、回收率高,且不需要专门的设备。该方法的主要缺点在于容易引入蛋白质和聚合物材料等其他污染物,使得提取的外泌体纯度较低。

    3 基于免疫亲和的分离技术

    外泌体磷脂双层膜中含有丰富的蛋白质和受体,如CD81CD63TSG101、上皮细胞粘附分子等,利用这些受体与配体之间的相互作用,使外泌体与特殊设计的磁性颗粒之间建立免疫亲和作用,可用于外泌体的分离富集。例如,Zarovni等报道了一种基于微孔板的酶联免疫吸附试验(ELISA)用于捕获和定量检测外泌体。尽管与UC产量相当,但是该方法具有快速、易于使用和与常规设备兼容的优势。该报道继续开发了一种基于磁免疫捕获的外泌体分离试剂盒用于从细胞培养基和生物液中分离外泌体,其质量和纯度均优于其他技术。此外,这种方法对样品的初始体积没有要求,可以很容易地缩小或增大样品容量。而该技术主要缺点在于缺乏最佳的外泌体标志物。此外,随着肿瘤的进展,肿瘤抗原表达和调节的异质性可能导致低估和假阴性,并且有些抗原表位可能被阻断或掩蔽。
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    +关注 私聊
  • 小兰兰小叮当

    第2楼2021/08/06

    一个很好的方法总结

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