超速离心法收集肿瘤细胞外泌体
将之前冻存于-80℃冰箱中的人肺腺癌细胞H1299，人胃癌细胞MGC-803和人乳腺癌细胞MDA-MB-231放入复苏盒，37℃水浴锅融化，1500 rpm离心3 min。在超净操作台中，丢弃上清液，迅速加入4 mL新鲜培养基，将细胞悬液混匀后转移到25 cm2的培养瓶中。倒置显微镜观察后放入37℃，5% CO2 恒温培养箱中培养。
细胞培养与传代
将H1299重悬于含有10%（v/v）FBS的RPMI-1640培养基中，在恒温培养箱中培养。当达到90%汇合时，去除旧培养基，加入PBS缓冲液清洗两遍以去除部分死细胞和细胞碎片。弃上清后，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液1 mL，在37℃条件下消化细胞2 min。通过倒置显微镜观察到细胞之间相互分离后，迅速加入2 mL新鲜培养基，轻轻吹打使培养皿上的细胞脱落，1500 rpm离心3 min。去除上清液，抽取适量细胞悬液加入新的培养皿中，补充适量培养基进去吹打混匀。放入培养箱中继续传代培养。MGC-803和MDA-MB-231在含10%（v/v）FBS的DMEM培养基中生长。其他操作与H1299细胞相同。
细胞冻存
配置冻存液FBS:DMSO=9:1，吹打混匀。取培养至覆盖培养皿表面90%的细胞，同传代步骤处理，离心后去除上清液，加入适量的冻存液后吹打均匀，转移至冻存管中密封，填写冻存信息，将冻存管放于冻存盒后转移至-80℃冰箱中备用。
培养基收集
细胞在无外泌体的培养基中生长至覆盖培养皿表面90%时，收集细胞培养上清。将上述培养基进行300 g，10 min的离心，以去除死细胞；收集的上清液继续进行2000 g，10 min的离心，用来去除细胞碎片；最后将上清液10000 g离心30 min，并用0.22 μm过滤器去除较大的细胞外囊泡，收集得到的溶液即为包含外泌体的培养基样品。
收集外泌体
首先，将培养基放入离心管进行严格配平，对称的两只离心管要精确到小数点后4位保持一致。将转子放入离心机时，要保证转子完全平衡。抽真空，慢慢将速度上升到100000 g进行70 min的离心。离心后弃上清加入PBS缓冲液，进行第二次100000 g，70 min的离心。弃去上清液，将产物重悬于100 μL PBS缓冲液中，放入-80℃冰箱中保存。
外泌体的透射电镜表征
首先取10 μL外泌体溶液与等量的4%多聚甲醛混匀滴加到铜网上，过夜风干将其固定在铜栅格上。采用20 μL 2%磷钨酸溶液负染3-5 min，用滤纸吸取多余的染料，可在100 kV的透射电镜下观察外泌体的形貌。
首先采用TEM观察了所捕获外泌体的形貌。如图所示，可从TEM图片中清楚的看到膜泡结构，所捕获外泌体具有典型的圆杯状膜结构，与之前报告的外泌体形貌一致。
图 1 透射电镜表征外泌体的形貌。标准尺：500 nm
进一步通过NTA确定了捕获外泌体的大小和分布。如图2所示，所捕获外泌体平均大小为110.1 ± 1.0 nm。此外，从图中可看出所捕获外泌体呈单峰分布，表明捕获的外泌体具有高纯度。
图 2 NTA表征外泌体的尺寸
将细胞培养液、富集后的外泌体洗脱液、富集后的上清液和洗涤缓冲液（第一次洗涤和第二次洗涤）用SDS-PAGE进行分离。如图3所示，通过对比其他泳道，Tim4@ILI-01免疫亲和材料分离的外泌体样品中70 kDa处的大量污染蛋白含量明显降低。
图 3 SDS-PAGE分析从4 mL培养基中分离出的外泌体蛋白质（考马斯亮蓝染色）
对分离得到的外泌体进行表征。通过TEM和NTA分析表明分离得到的外泌体的形貌和大小与文献报道一致。Western blotting实验结果表明，经富集后的细胞培养基中的外泌体标志性蛋白质HSP70、CD63、TSG101和CD81的含量比富集前显著提高。
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