血清样品中外泌体的分离
血液样品的收集
本研究经河北大学附属医院机构评审委员会(IRB)批准。健康人血清和肺腺癌患者血清经许可从河北大学附属医院获得。收集的血清样本，在4℃的条件下，3000 g离心10 min。使用前，通过离心处理后用0.22 μm过滤器过滤，在-80℃冰箱中保存。
数据处理及统计学分析
数据分析采用GraphPad Prism 6.0统计程序进行。所有数据均以3次独立实验的平均数±标准差（SD）表示。多组均数间比较采用单因素方差进行统计分析。两组间的实验设置比较采用非配对t检验。p<0.05被认为有统计学意义。
近年来，血清外泌体提供了丰富的蛋白质、microRNA等生物标志物，已成为多种疾病非侵入性诊断的重要手段。通过从健康人和肺腺癌患者血清中连续提取外泌体，进一步验证了Tim4@ILI-01免疫亲和材料的临床应用潜力。我们成功地从8名健康人和8名患者的血清中分离出高浓度的外泌体。具有代表性的NTA结果如图3-19 A所示，捕获的外泌体平均大小为92.7±2.7 nm。同样，捕获的外泌体也具有狭窄的粒径分布。进一步比较了两种样品中捕获外泌体的浓度。肺癌患者捕获的外泌体浓度明显高于健康人血液中捕获的外泌体（图B）。通过NTA数据处理，肺癌患者捕获的外泌体浓度比健康人高5.6倍（图C）。进一步对健康人和肺腺癌患者的外泌体样本中的蛋白质含量进行定量分析。我们使用重复3次的外泌体蛋白定量结果进行PCA分析。如图D所示，两组之间可以很好地分开，说明健康组和患者组有显著差异。上述结果可进一步通过Western blotting进行验证。肺癌患者的标志物蛋白浓度明显高于健康人标志性蛋白质的浓度（图E）。
图1 健康人群和肺癌患者临床血清样本的外泌体分析：（A）外泌体大小分布；（B）捕获外泌体的颗粒计数；（C）箱形图与点形图重叠；（D）外泌体蛋白的主成分分析；（E）外泌体标记物的Western blotting结果
CD44作为肿瘤干细胞基因，被认为在调控干细胞增殖中发挥重要作用。近年来，人们发现肿瘤源性外泌体中含有CD44基因，促进细胞侵袭和迁移。实验进一步比较了CD44蛋白在五例肺腺癌患者的不同阶段的表达情况，包括癌症治疗前、治疗后缓解（PR）和疾病进展（PD）。Western blotting分析结果如图2所示，CD44蛋白在肺癌患者血清中的表达水平显著高于健康人；经进一步治疗后，CD44蛋白表达水平因部分缓解而明显下降；而当患者耐药后癌症进一步进展时，CD44蛋白表达水平进一步显著升高。以上研究结果表明，外泌体中CD44基因有可能成为肺腺癌的预测标志物之一。上述结果也进一步表明Tim4@ILI-01免疫亲和材料在临床中的应用潜能。
图2 不同分期肺癌患者捕获的血清外泌体CD44蛋白表达：（A）Western blotting；（B）表达CD44蛋白的相对定量。
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