外泌体对耐药性的影响
（1）分别用0、1、10 μM的含顺铂培养基培养细胞，待3天后，收集各自培养上清，编号为1、2、3。
（2）经前期预处理后用Tim4@ILI-01免疫亲和材料分别富集1、2、3培养基中的外泌体。
（3）将另一瓶生长好的细胞消化处理计数，均匀的传到3个皿中。待细胞过夜后，将上述分离得到的外泌体加入这三个皿中培养3天。
（4）分别将3个皿中的细胞按照上述步骤铺96孔板，检测用不同浓度顺铂处理细胞后，细胞分泌的外泌体对细胞耐药性的影响。
顺铂处理后细胞外泌体的分泌
为了进一步验证Tim4@ILI-01免疫亲和材料的捕获性能，采用不同浓度的顺铂处理H1299细胞来验证Tim4@ILI-01免疫亲和材料是否可以检测细胞培养上清液中外泌体分泌的变化。如图所示，随着顺铂浓度的增加，细胞活力持续下降，细胞分泌外泌体的浓度随着药物浓度的增加呈现先小幅增加后持续下降的趋势。外泌体浓度的下降主要是由大多数细胞活性降低所致。活细胞数量及其形态变化进一步证实了顺铂仅在特定浓度下调控癌细胞外泌体的分泌，顺铂诱导细胞毒性存在浓度依赖性机制（图B）。为了进一步验证外泌体是否能提高细胞的化疗耐药能力，我们用不同浓度的顺铂（0 μM，1 μM和10 μM）处理细胞，其分泌的外泌体孵育下一代细胞后，细胞在相同刺激条件下存活率较对照组明显提高，以10 μM浓度效果最好（图C）。实验表明，H1299细胞暴露于特定浓度的顺铂后，外泌体的分泌量增加，并且这些外泌体可以降低其他H1299细胞对顺铂的敏感性，增加了它们对顺铂的耐药性。以上研究表明，来自肺腺癌的外泌体在肺癌化疗耐药中起着重要作用，这个结果与之前的报道一致。
图1顺铂对H1299细胞外泌体分泌的影响：（A）H1299细胞的剂量反应；（B）不同浓度顺铂处理H1299细胞3天后的形态；（C）外泌体作用后的H1299细胞对顺铂的剂量反应。 比例尺：200 μm
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