Tim4@ILI-01免疫亲和材料的制备及表征
将8 mg的ILI-01 MOFs材料分散在1 mL的PBS缓冲液中，依次分别加入EDC·HCl（25 mg）和NHS（15 mg），室温下充分混匀上述溶液，5500 rpm离心5 min收集活化的ILI-01 MOF材料，PBS洗涤3遍，继续以相同的条件离心收集ILI-01 MOF材料。随后，加入anti-Tim4抗体、anti-CD63抗体或anti-CD81抗体（1μg/μL），于4℃孵育过夜。最后将获得的Tim4@ILI-01免疫亲和材料用PBS洗涤3次，以备后续使用。
1 Tim4@ILI-01免疫亲和材料的表征
为了证实Tim4抗体是否成功偶联到ILI-01 MOFs材料上，将FITC标记的荧光二抗IgG（羊抗鼠）10 μL与ILI-01 MOFs材料和Tim4@ILI-01免疫亲和材料分别避光孵育1 h，用PBS洗涤三次。用荧光倒置显微镜分别观察Tim4@ILI-01免疫亲和材料结合FITC标记的荧光二抗、ILI-01 MOFs材料与荧光二抗共育后的材料和未修饰的Tim4@ILI-01免疫亲和材料。
由图1可知，Tim4@ILI-01免疫亲和材料本身无荧光信号（C，F），与荧光二抗孵育后显示出强的荧光信号（A，D），而ILI-01 MOFs材料即使与荧光二抗孵育也没有出现荧光（B，E）。以上实验数据可验证ILI-01 MOFs材料已成功与Tim4抗体连接，并且偶联上的抗体具有生物学活力。
图1 Tim4@ILI-01免疫亲和材料(A, D)和ILI-01 MOFs材料(B, E)与FITC标记的羊抗鼠IgG以及对照Tim4@ILI-01免疫亲和材料(C, F)的明场和荧光场图像(激发362 nm，发射488 nm)。其中，A、B和C为明场；D、E和F为荧光图像。比例尺:1 μm
进一步通过蛋白定量实验测定抗体孵育前后上清液中蛋白的OD值，计算出anti-Tim4抗体的结合量约为4.1 ± 0.1 μg，结合效率可达82.4%（如图2），优于之前报道的anti-CD63抗体与大孔石墨烯泡沫（GF）连接的结合率。因此，基于ILI-01 MOFs材料表面丰富的羧基，可以高效结合抗体，可潜在提高后续外泌体的捕获效率。
图2 ILI-01 MOFs材料表面Tim4抗体固定化的评价。a、b为与ILI-01 MOFs材料孵育前后溶液中Tim4抗体的浓度。插入图显示了BCA标准曲线
为了进一步阐明外泌体的捕获和释放过程，采用Tim4@ILI-01材料富集外泌体后，分别加入CD63和TSG101抗体进行孵育，经过3次洗涤后，加入FITC标记的山羊抗兔IgG进行避光孵育。通过免疫荧光实验对捕获的外泌体进行特异性识别。如图所示，Tim4@ILI-01材料经过后续的免疫反应未见荧光信号（图 A，D）。捕获外泌体后的材料表面可观察到强的荧光信号（ B，E）。添加EDTA螯合剂后，外泌体与材料分离，洗脱液中存在荧光信号（ C，F），表明捕获的外泌体已成功从Tim4@ILI-01免疫亲和材料中释放出来。
图3 外泌体捕获和释放过程的荧光图像：（A，D）Tim4@ILI-01免疫亲和材料（B，E）捕获外泌体后的Tim4@ILI-01免疫亲和材料（C，F）洗脱液中释放的外泌体。比例尺：1 μm
制备了Tim4@ILI-01免疫亲和材料。通过标记荧光二抗后可在Tim4@ILI-01免疫亲和材料表面观察到强荧光，表明Tim4抗体成功修饰到ILI-01 MOFs材料上。
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