Tim4@ILI-01免疫亲和材料收集外泌体
称取8 mg Tim4@ILI-01免疫亲和材料，加入4 mL含2 mM CaCl2的上述细胞培养上清液，在4℃条件下在摇床上振摇孵育2 h。将上述混合物于5500 rpm离心5 min，弃去上清，继续用1 mL的洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.0005% Tween 20, 2 mM CaCl2）重复洗涤三次。继续加入100 μL EDTA洗脱液（20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA）与上述材料孵育15 min，离心后收集上清，即得外泌体。
捕获条件的优化
取10 μL上述超离后外泌体样品作为标准品。在4℃条件下，取10 mg Tim4@ILI-01免疫亲和材料加入10 μL外泌体标准品，分别孵育 30 min、60 min、90 min、120 min、180 min，NTA法测试上清中外泌体的浓度，并寻找最适的孵育时间。在此条件下，分别称取1 mg、2 mg、5 mg、8 mg和10 mg Tim4@ILI-01免疫亲和材料与外泌体标准品在4℃中孵育，利用NTA法测试上清中外泌体的浓度，并计算出最佳的材料用量。
捕获效率优化
为寻找最佳的捕获条件，我们对材料用量，孵育时间，捕获靶标和适用的细胞种类进行了优化。如图1A所示，随着材料的含量从1.0 mg增加到8.0 mg，富集效率逐渐提高，达到最大值84.7±4.0%。进一步增加Tim4@ILI-01材料的用量，富集效率并没有提高反而略有降低。因此，我们选择8.0 mg的Tim4@ILI-01免疫亲和材料用于后续实验。孵育时间对捕获效率的影响如图1 B所示。在其他条件保持一致的情况下，通过延长孵育时间，捕获效率可逐渐提高，并在120 min内达到最大捕获率85.2±3.0%。继续增加孵育时间不能进一步提高富集效率。因此，最终选择120 min作为最佳孵育时间。
图1 优化富集条件：Tim4@ILI-01免疫亲和材料用量（A）和孵育时间（B）
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