超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法的优化

超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法的优化

户江涛（黑龙江省农垦科学院测试化验中心）

摘要：对超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法进行了优化。试样经酶解，高氯酸、MCX柱净化后，5种β-受体激动剂在C18色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，进行液相色谱分离，同位素内标法定量；质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明，5种β-受体激动剂在0.5-25 ug/L范围内线性关系良好，相关系数（R）为0.9991-0.9996，定量限为0.5 ug/kg。在猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、鸡蛋空白样品添加浓度为0.5、2、10 ug/kg， 5种β-受体激动剂的平均回收率为95.3%-108.7%，相对标准偏差（RSD）为3.27%-8.57%（n=6）。本方法简便、灵敏、高效，适用于动物源性食品中β-受体激动剂含量检测。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；动物源性食品；β-受体激动剂

β-受体激动剂是一种β-肾上腺素兴奋剂，主要用于治疗人、动物支气管哮喘挛等。在用于畜牧饲喂时意外发现有减少脂肪沉积，提高瘦肉率的作用，因此又被称为“瘦肉精”。由于β-受体激动剂化学结构稳定、半衰期较长，容易在动物组织中残留，长期食用含β-受体激动剂残留的食物可能会引起中毒，并对人体健康造成很大伤害。

我国农业部早在2002年就发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品目录》公告，禁止在食用动物饲养中使用克伦特罗等β-受体激动剂。虽然早已被禁，但“瘦肉精事件”仍然时有发生：2011年央视“3·15”晚会曝光了河南孟州等地养猪场采用“瘦肉精”饲养生猪，有毒猪肉流入济源双汇食品有限公司；然而十年后的2021年央视“3·15”晚会再次曝光了河北青县羊肉“瘦肉精”事件，动物源性食品安全问题再次受到各界广泛关注。

目前，动物源性食品中β-受体激动剂的检测方法主要有酶联免疫法、GC/MS法和LC-MS/MS法。酶联免疫法具有快速、灵敏度较高等优点，但存在较大的假阳性风险，一般仅作为初筛方法；GC/MS法灵敏度较低，且需要衍生化处理，操作步骤较繁琐。LC-MS/MS法特别适合β-受体激动剂这类难挥发、沸点较高的极性化合物检测，现已成为食品中该类兽药的主要检测手段。

我国动物源性食品中β-受体激动剂LC-MS/MS法的相关标准包括《GB/T 22286-2008》、《GB/T 21313-2007》、《农业部1025号公告-18-2008》等，这几个方法标准的前处理步骤都比较繁琐、耗时长（反复调节pH值、多次转移离心）、有机试剂消耗量大。本文通过大量实验研究，对上述方法标准前处理进行优化，建立了一种前处理步骤简便、灵敏度高、有机试剂用量少的快速、高效、准确检测动物源性食品中β-受体激动剂残留的UPLC-MS/MS法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、氯丙那林对照标准溶液及其相应同位素内标（100 ug/mL，农业部农产品质量标准研究中心）；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（sigma公司）；MCX混合型阳离子交换柱（60 mg/3 mL，Waters公司）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；高氯酸、氨水（优级纯，科密欧公司）；实验用水为Millipore纯水仪制备。

1.2 标准溶液和乙酸铵缓冲液配置

1.2.1 5种β-受体激动剂混合标准溶液（0.2 ug/mL）配置：分别准确吸取50 uL的上述5种β-受体激动剂对照标准溶液（100 ug/mL）至25 mL容量瓶中。

1.2.2 5种β-受体激动剂混合内标溶液（0.2 ug/mL）配置：分别准确吸取50 uL的上述5种β-受体激动剂内标溶液（100 ug/mL）至25 mL容量瓶中。

1.2.3 乙酸铵缓冲液（0.2 moL/L）：称取15.4g乙酸铵，溶解于1000 mL水中，用适量乙酸调pH至5.2。

表1 5种β-受体激动剂的质谱参数

﹡定量离子

图1 5种β-受体激动剂标准溶液（5 ug/L）MRM色谱图

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

目前，我国动物源性食品中β-受体激动剂检测相关标准的前处理步骤基本一致，以《农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱－串联质谱法》为例：先对样品进行酶解，然后对酶解液用高氯酸调pH至1.0（沉淀蛋白等杂质），离心后上清液再用 NaOH溶液调pH至9.5（碱性条件下β-受体激动剂呈分子状态），再依次加入乙酸乙酯（15mL）/叔丁基甲醚（10mL），合并有机相用氮气吹干，残渣用2%甲酸溶液5mL溶解后过MCX柱，洗脱氮吹定容离心后上机检测。

上述前处理过程需要两次调节pH、使用大量有机试剂，耗时长，且用有机试剂反提时容易造成目标物损失，影响回收率。β-受体激动剂呈弱碱性，在酸性环境中成离子状态，酶解液加入高氯酸离心后上清液呈酸性，直接过MCX柱可以减小后续有机试剂反提过程的损失，也更加经济环保。对同一阳性样品（克伦特罗），分别采用本文1.3和《农业部1025号公告-18-2008》步骤进行前处理，两种方式最终测定结果基本一致（见表2）。同时，本方法采用同位素内标可有效监测目标物前处理过程损失，尽可能消除基质效应的影响，使最终定量结果更加准确可靠。

表2 克伦特罗阳性样品应用不同前处理方法的测定结果

表3 5种β-受体激动剂标准溶液的线性方程、相关系数

表4 不同基质中5种β-受体激动剂克伦特罗加标回收率和相对标准偏差（n=6）