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QuEChERs-高效液相色谱-串联质谱法测定不同茶类中芸苔素内酯的应用

SH104301

2021/10/15
仪信通会员战队

液相色谱（LC）

背景

油菜素甾醇（BRs）是一类重要的植物激素，自20世纪70年代发现以来，人们已鉴定了超过50多种天然的油菜素甾醇。BRs在植物的生长发育过程中发挥了至关重要的作用，调控着细胞伸长分裂、维管束分化、种子萌发、生根、花粉管形成等多项生理学过程，能显著提高植物对环境胁迫的抵抗能力。目前，油菜素甾醇的合成、代谢路径和信号传导机理还未完全探明，监控植物中油菜素甾醇含量的变化对相关机理研究具有重要的指导意义。然而，内源性油菜素甾醇含量低、植物样品基质复杂，现有分析方法多数难以满足植物学家对BRs分析检测的要求。

为了实现油菜素甾醇的检测，分析化学工作者开发了基于酶联免疫法、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱与紫外-可见检测器/荧光检测器或串联质谱联用的多种分析方法。其中，液相色谱-串联质谱联用技术是目前主流的检测手段。虽然油菜素甾醇在大气压化学电离（APCI）源和电喷雾电离（ESI）源质谱上均可产生响应信号，但检出限较高，不能满足少量植物样品中痕量油菜素甾醇的分析需求。有研究以丹酰-3-氨基苯硼酸、2-溴-吡啶-5-硼酸、3-氨基苯硼酸、3-Ｎ，Ｎ-二甲氨基苯硼酸衍生油菜素甾醇，通过引入易电离的氨基或吡啶基团，提高了衍生产物的电喷雾质谱离子化效率，将检出限降低至pg级。然而，上述衍生反应需要加入毒性大的吡啶作为催化剂，且反应时间较长。且衍生试剂通常活性较高难以长期保存。

本方法基于QuEChERs方法，结合高效液相色谱-串联质谱快速测定植物组织中芸苔素内酯的方法。样品经乙腈均质提取，通过氯化钠（NaCI）和无水硫酸镁（MgSO4）混合吸附剂分散萃取，结合gcB/PSA双层固相萃取柱前处理，以ChromCore? C18色谱柱分离，采用ESI正离子扫描和多反应监测模式（MRM）检测，基质匹配溶液外标法定量。芸苔素内酯在1~100 mg/mL范围内线性良好（R2 >0.999）。在不同中标准样含量20、40和200 μg·kg-1 添加水平下，目标化合物回收率均介于 75.5%~93.6%之间，相对标准偏差 RSD 值在 0.4%~7.0%之间（n=6），方法定量限（LOQ，S/N=10）在 0.55~1.46 μg·kg-1 之间。该方法稳定、准确、灵敏，能够满足各茶类检测需求。

实验步骤

1.样本制备：

样本与液氮中冷冻研磨至粉末状，样品粉碎后过 200 μm筛，称取0.1 g样本（精确至 0.01 g）（转移至2 mL EP管中，加入1 mL乙腈，涡旋混匀1 min，于冰冷中超声30 min，粗提液以4 ℃ 12000 r/min离心10 min后，取上清液，备用。

2.净化：

SPE柱：SelectCore gcB/PSA 500mg/500mg/6mL 双层萃取柱；

活化：5 mL乙腈活化；

上样：加入步骤1中制备好的上清液，并收集上样液；

洗脱：用3 mL乙腈/甲醇（1:1 V:V) ,收集全部洗脱液；

洗脱液于35 ℃下旋转蒸发至干，待衍生；

3.样本衍生：

用1 mL(3-（N,N-二甲基氨基）苯基硼酸/乙腈（1:1）)复溶，在40 ℃水浴中加入1 h后，冷却至室温，然后用0.22 μm的针头过滤器待测,供液相色谱串联质谱分析。

4.液相色谱条件：

Column:ChromCore ?C18 5μm

Dimension :2.1×150

Mobile Phase： A)0.1%HCOOH water

B)0.1%HCOOH ACN

Gradient：

t（min）
A
B
0
30
70
2
15
85
7
5
95
10.5
5
95
20
30
70

Flow Rate：0.3 mL/min

Temperature：30 ℃

Injection Quantity：5 μL

质谱条件：

ESI in positive ionization mode

Ion Spray voltage：5500 V

Souree Temperature：200 ℃

Nebulizer Gas：40 psi

Figure1：MS/MS spectra and proposed fragment pathways of BLDMAPBA，Leu-enkephalin was used as lock mass in MS/MS mode (m/z610.4276for positive ion mode) to ensure the accuracy of m/z。

Figure2：MS/MS/MS spectra of CS and BL. The MS/MS/MS scan was performed on the MS system. 610.4.190.1. of BL. The excitation energy was 0.11 V, and the ?ll time was 50 ms。

Figure3：10ng/mL Multi-reaction monitoring of standard solution Mass Spectrogram（MRM)

公司名称：苏州格锐思生物技术有限公司

个人信息：顾××老师

色谱柱信息：

纳谱分析ChromCore C18 5μm, 2.1mm×150mm, 序列号：21514-001014

纳谱分析SelectCore gcB/PSA 500mg/500mg/6mL 双层萃取柱

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